Способ определения пестицидов и лекарственных веществ антихолинэстеразного действия

 

Использование: аналитическая химия, химико-токсикологический анализ, контроль объектов окружающей среды. Сущность изобретения: фермент, обладающий холинзстеразной активностью, смешивают с субстратной хромогенной смесью и анализируемой пробой, определяют степень угнетения активности фермента по скорости изменения окраски в сравнении с контролем и содержание анализируемых веществ о пробе по степени угнетения активности Фермент используют в виде твердого раствора в натриевой или аммониевой соли N- фталилхитозана, к которому перед смешиванием добавляют воду или буферный раствор до содержания М-фталилхитозана 0,02-0,1 мае. %. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (l9) (!!) (я)з С 12 0 1/46

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4785371/13 (22) 22.01.90 (46) 07.07.92. Бюл. в 25 (71) Ленинградский технологический институт им. Ленсовета и Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.M.

Сеченова (72) А.А. Прокопов, А.В. Святковский, Е.Б. Никольская и Л.П. Кузнецова (53) 577.15.08(088.8) (56) Методические рекомендации по определению активности холинэстераз и антихолинэстераэной эффективности инсектоакарицидов. ВАСХНИЛ, M., 1986, с. 15-18.

Химико-токсикологические методы.

Справочник. LI., Агропромиздат, 1989, с. 124-126.

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к химико-токсикологическому и клиническому анализу и контролю.объектов окружающей среды.

Известен способ определения пестицидов антихолинэстераэного действия, использующий фермент в виде нормальной сыворотки крови лошади, и включающий смешение фермента. анализируемой пробы и субстрата и оценкустепени угнетения активности фермента по скорости изменения окраски по сравнению с контролем. Этот метод используется для определения микроколичеств дихлофоса, диброма, циодрина, а после концентрирования экстрактов— хлорофоса.и амидофоса. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕСТИЦИДQB И ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ

АНТИХОЛИНЭСТЕРАЗНОГО ДЕЙСТВИЯ (57) Использование: аналитическая химия, химико-токсикологический анализ, контроль обьектов окружающей среды. Сущность изобретения: фермент, обладающий холинэстеразной активностью, смешивают с субстратной хромогенной смесью и анализируемой пробой, определяют степень угнетения активности фермента по скорости изменения окраски в сравнении с контролем и содержание анализируемых веществ в пробе по степени угнетения активности фермент используют в виде твердо о рас. твора в натриевой или аммониевой соли Мфталилхитозана, к которому перед смешиванием добавляют воду или буферный раствор до содержания N-фталилхитозана 0,02-0,1 мас,, 1 табл.

Недостатками метода являются невысокая чувствительность, узкий круг определяемых веществ и сложность проведения анализа, Известен способ, использующий фермент в виде промышленных препаратов, По данному способу в ячейку вводят раствор препарата фермента, анализируемую пробу (экстракт из патматериала), раствор субстрата (ацетилхолин) и бромтимоловый синий (индикатор). Степень угнетения активности фермента устанавливают по изменению окраски индикатора от синей до синевато-желтой.

Недостатками прототипа являются недостаточно высокая чувствительность, огра1745769

4 ниченные технологические воэможности и сложность проведения анализа.

Целью изобретения является повышение чувствительности, расширение технологических возможностей и упрощение анализа.

Поставленная цель достигается тем, что фермент используют в виде твердого раствора в натриевой или аммониевой соли Nфталилхитозана, и перед смешением к ферменту добавляют воду или буферный раствор до концентрации N-фталилхитозана 0,02-0.1 мас. .

Пример1. Готовят 0,2 -ный водный раствор натриевой соли М-фталилхитозана.

К 10 мл раствора полимера добавляют 76 мг промышленного препарата бутирилхолинэстерезы из сыворотки крови лошади (КФ

3.1.1.8) с активностью 6Е/мг (общая активность 456 Е). Полученный раствор разливают в ячейки планшета по 0,02 мл, высушивают на воздухе и получают в них дозированные количества твердого раствора фермента в полимере. Перед определением параоксона в 10 ячеек с твердым раствором вносят по 0 1 мл 0 01 М фосфатного буфера (рН 8;О), растворяют в течение

1 мин (получают 0,04 -ный раствор полимера), последовательно в каждые 2 ячейки добавляют по 0,02 мл водного раствора параоксона в концентрациях 0; 1 10; 1 10;

1 10;1 t0 моль/л, фиксируя время внесения ингибитора. Точно через 2 мин инкубации ингибитора с ферментом в ячейки добавляют по 0,08 мл 8.10 моль/л раствора индофенилацетата в 8 об. -ном зтаноле.

Измеряют время изменения окраски от желтого до зеленого цвета, Весь анализ проводят при комнатной температуре, Результаты определения представлены в таблице.

Пример 2. Проводят определение параоксона аналогично примеоу1 в концентрациях 0; 1 10; 1 10; 1.10 моль/л, увеличив время инкубации ингибитора с ферментом до 10 мин.

Пример 3. Проводят определение параоксона аналогично примеру 1, получая после растворения твердого раствора 0,020,2 -ные растворы аммониевой соли Nфталилхитозана.

Пример 4. В условиях примера 1, используя 0,1 -ные растворы полимера и не проводя инкубацию фермента с ингибитором. определяют атропин, метацин, N-метил-4-пиперидинилбензилат и скопаламин, взятые в концентрациях 1 ° 10; 1 ° 10 ; 5x х10; 1 10 соответственно, Пример 5. Проводят определение диизоп ропилфторфосфата аналогично примеру 1.

Пример 6. Проводят определение

5 хлорофоса в концентрациях 0; 1 10; 1 10 аналогично примеру 1.

tl р и м е р 7. Проводят определение хлорофоса аналогично примеру 1. Растворы предварительно активируют при 70 С и рН10 9,0 в течение 0.5 ч.

Пример 8. Проводят определение

ДДВФ аналогично примеру 1 °

Пример 9. 10 r тщательно измельченного мяса помещают в склянку с притертой

15 пробкой и заливают 10 мл хлороформа, содержащего параоксон в концентрации 1х х10 моль/л, и экстрагируют в течение 1 ч.

Затем фильтруют через вату, отбирают 1 мл экстракта и высушивают на воздухе. Сухой

20 остаток растворяют в 1 мл дистиллированной воды, Определение параоксона в полученном растворе проводят аналогично примеру 1. Хлороформ в контрольной пробе не содержит параоксона, 25 Пример 10, Готовят 0,1 -ный водный раствор натриевой соли N-фталилхитозана.

К 10 мл раствора добавляют 100 Е промышленного препарата ацетилхолинэстеразы из эритроцитов крови человека (КФ 3.1.1.7) и

30 1,5 мг бромтимолового синего. Полученный раствор разливают в ячейки планшета по

0,02 мл, высушивают на воздухе и получают в них дозированные количества твердого раствора фермента в полимере. Перед опре35 делением армина в ячейки вносят по 0,1 мл

0.01 моль/л фосфатного буфера (рН - 7,5), растворяют в течение 1 мин (получают

0,02 -ный раствор полимера). последовательно в каждые две ячейки добавляют по

40 0,02 мл водного оаствора армина в концентрациях 0; 1 10; 1 10; 1 10 и 1 10 моль/л, фиксируя время внесения ингибитора. Точно через 5 мин инкубации фермента с ингибитором в ячейки добавляют по

45 0,08 мл 2,5 10з моль/л ацетилхолинхлорида. Измеряют время изменения окраски от синей до зеленовато-желтой. Одновременно определение армина проводят по известному и предлагаемому способам с

50 иммобилизованной в желатине ацетилхолинэстераэой.

Пример 11. Проводят определение параоксона аналогично примеру 1. Используют твердые растворы бутирилхолинэсте55 разы в аммониевой соли N-фталилхитозана, приготовленные непосредственно перед определением, эа 1 и 3,5 года до него.

Предлагаемый способ позволяет быстро и легко проводить определение широко745769

Предел обнарумения, моль /л

Время изменения окраски

Ингибитор

Время npo"" аедения анализа, ммн

Концентрация инги битора, ноль/л

Пример

Показания

Концентрация по« линера, 2

0,04

2025с

50+10 с

2-3 мин

30-40 нин

>40 мин

О

1 ° 10 C

io y

1 ° 10

1-10 >

Параоксом

2 0,04

2025 с

40410 с

2-3 ммн

20-30 иин

2035 с

50410 с

3 нин бремя мнкубации увеличено до 10 нмн

10"T

3 0,02

«н»

1 ° 10

1,10-У

I1»

0,04

О

1 10 С

1910 9

2015 с

50 10

2-3 ннм

2015 с

50»910 с

2-3 иин

50210 с

50+10 с

3-4 ннн

О

-с

1 ° 10 э

О

1 ° 10 а

1.100,1

10 с

3 0,15

1О

Окраска неняется от мел!ого цвета до розового

О

1,10-4

1 1Ов

0,2

60И5 с

60315 с

3-4 мнн н

2045 с

50110 с

10 с

1 10 4 дтропин

50110 с 10

Иетацин

И-Иетнл-4пмпермдиммлбензнлат

5 10

1 ° 10! О"

40„10 с

50210

Скопаланин

5 0,04

О

1.1О-с

l 910-с

1 110"

1 Г10

2О25 с

50210 с

2-3 мин

30-40 нни

>40 м«н

ДнизопропмлеторФОСФа т

10 с

2195 с

5".

2-3 «мч

0;Î!

;:.-" т-сс": .

I

)- э

2025 с

50!О с

2-3 мнн

2095 с

5O»+10 с

2-3 мин

°, О-с т. "Г я

° О

1 ° 10-4

1 ° 10 е

-9 - 99«

В«ГВВЧ«Я ьДВФ

° 0.44

10 а имгмби ор экстоагироеапи нэ мяса

2095 с

50 Ос

О

1 .O"

9 0904

10 0,02

Параоксон!

15«2 с

2212 о 3-4 мин

) 30 мин

>30 мин

О

1 ° 10 е

1.10 1

1 ° 10 а

1 ° 10 дрмин

1О-а

3025 с

ЗОэ5 с

3015 с

60215 с

3 4 мин

1 ° 10=4

1 ° 10 1

I ° 1O а

1.10-в, н

Изаест«9а! способ

Фермент 9в9мобипиэо° ан ° мелатине

1,5 99

1ектзэчая

° реня мабукамия) 350130 с

350930 с

6002100 с

> 20 ним

О

1-10-а

1 .10-1

1 ° 1O-а

r0 круга соединений, обладающих антихолинэстеразной активностью, обеспечивает низкий предел обнаружения ингибиторов, имеет широкие технологические возможности (например, проведение анализа в массовом порядке в полевых условиях).

Формула изобретения

Способ определения пестицидов и лекарственных веществ антихолинэстеразного действия, включающий смешение фермента, анализируемой пробы и субстрата и оценку степени угнетения активности фермента по скорости изменения окраски в сравнении с контролем, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительно5 сти, расширения технологических возможностей и упрощения анализа, фермент используют в виде твердого раствора в натриевой или аммбниевой соли N-фталилхитозана и перед смешением к ферменту

10 добавляют воду или буферный раствор до концентрации N-фталилхитозана 0,02-0,1 мас.7о.

1745769 концентра- Ореия иэ- Оремл проция инги- менения ведения битора ° окраски анализа, моль/л иин

2045 с Сразу после приго50т10 5 товления твердого раствора,7., 8

Продолжение таблицы

Предел обнарукения, ноль/л

Пример конвент- Ингмбмтор рацил полимера,t

Показания

11 0,04 i Параоксон

О

1 ° 10

10 Е

l.10-C

20>5 с

50410 с

2035 с

50з10 с

Через 1 год после

5 приготовления

10-6

О

1.10-е цврвз 3,5 года после

5 приготовления

Составитель А. Семенов

Редактор Н. Гунько Техред М.Моргентал Корректор О. Ципле

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2365 Тираж . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5