Способ обнаружения эндотоксинов грамотрицательных бактерий

 

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к лабораторным методам выявления эндотоксинов грамотрицательных бактерий. Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение способа. Исследуемую пробу смешивают с кровью, инкубируют 30 мин при 37°С и готовят мазок, который фиксируют метанолом, обрабатывают неиммунной сывороткой или плазмой крови, инкубируют 30 мин и отмывают фосфатно-солевым раствором. Затем на мазок наносят флюоресцирующие антитела к Re-гликолипиду, снова инкубируют 30 мин, отмывают и микроскопируют в УФ-свете. При наличии в исследуемой пробе эндотоксина на мазке видны ярко светящиеся участки (эндотоксин , фиксированный на полиморфно-ядерных лейкоцитах).

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (i9) (!!) (5!)5 6 01 N 1/28 л ) |Г!, 4

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4744543/14 (22) 29.09.89 (46) 23.07.92. Бюл. М 27 (71) Научно-исследовательская лаборатория бйологически активных веществ гидробионтов и Научно-исследовательский институт морфологии человека AMH СССР (72) M.lO. Яковлев, А,Н, Крупник, В.Г. Лиходед, В.M. бондаренко, Н.К. Пермяков, А.В. Аполлонин, Г.P. Булатова, M.Ô, Писаренко, А.Л. Сторожев, Е,В, Суджан и Р.А, Уразаев (56) J, Inf, Dls, 1977, ч. 135, р, 965 — 969, (54) СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ЭНДОТОКСИНОВ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ 6AKTFРИЙ (57) Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к лабораторным меИзобретение относится к медицине и ветеринарии, в частности к лабораторным методам выявления эндотоксинов грамотрицательных бактерий, Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение сгособа.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу обнаружения эндотоксинов путем применения флюоресцирующих антител к Re-гликолипиду. исследуемую пробу смешивают с кровью, из крови готовят мазок, который обрабатывают вначале плазмой или сывороткой крови неиммунизированных животных, а затем флюоресци- рующими антителами к Re-гликолипиду, О присутствии эндотоксина в исследуемой пробе крови судят по наличию ярко светящихся участков на поверхности нейтрофилов при микроскопировании в УФ-свете, тодам выявления эндотоксинов грамотрицательных бактерий. Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение способа. Исследуемую пробу смешивают с кровьЮ, инкубируют 30 мин при

37 С и готовят мазок, который фиксируют метанолом, обрабатывают неиммунной сывороткой или плазмой крови, инкубируют 30 мин и отмывают фосфатно-солевым раствором. Затем на мазок наносят флюоресцирующие антитела к Re-гликолипиду, снова инкубируют 30 мин, отмывают и микроскопируют в УФ-свете. При наличии в исследуемой пробе эндотоксина на мазке видны ярко светящиеся участки (эндотоксин, фиксированный на полиморфно-ядерных лейкоцитах).

Пример. В качестве исследуемой пробы используют раствор, содержащий липополисахарид К, coll CIII a концентрации 5 10 мкгlмл. 1 мл раствора смешивают с 4 мл крови кролика, выдерживают 30 мин при 37 С, готовят тонкий мазок, фиксируют . метанолом в течение 5 мин и отмывают в течение 10 мин фосфатно-солевым буфером (рН 7,2), На мазок наносят сыворотку или плазму крови неиммунизированных животных, выдерживают в течение 30 мин, отмывают тем же фосфатно-солевым буфером в течение 10 мин и наносят флюоресцирующие антитела к Re-rnuxonvnupy. Через

30 мин мазок отмывают фосфатно-солевым буфером в течение 10 мин и сразу же под- вергают микроскопированию в микроскопе

Люмам И1 при увеличении х 350 с иммерсией, На мазке были видны ярко светящиеся участки (1 — 3 в поле зрения). В отдел ьн ых

1749758

Составитель А, Древэль

Техред М.Моргентал, Корректор M. Мэксимишинец

Редактор И. Дербак

Ф, "

Заказ 2590 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 полях зрения ярко светящиеся участки могут отсутствовать. Заключение о наличии зндотоксина в исследуемой пробе крови делают в том случае, если ярко светящиеся участки обнаружены при просмотре пяти полей зрения;

8 контрольном опыте мазки предварительно не обрабатывают нормальной сывороткой кролика, Это приводит к формированию при микроскопировании фона неспецифического свечения вследствие неспецифического связывания флюоресцирующ а антител с клетками крови, что затрудняет выявление ярко светящихся . участков специфического связывания и снижает чувствительность способа. Следовательно. обработка мазков нормальной сывороткой подавляет неспецифическую флюоресценцию. Таков же действие оказывает нормальная плазма крови. - .Во втором контрольйом опыте предварительно обрабатывают намеченными антителами к Re-гликолипиду, а затем— флюоресцирующими энтителэми к Re-гликолипиду. В этом случае светящиеся участки отсутствуют, так кэк участки специфического и неспецифического связывания флюоресцирующих антител заблокированы

5 намеченными антителами к Re-гликолипиду. Эти данные свидетельствуют о специфичности связывания флюоресцирующих антител к йе-гликолипиду.

10 Формула изобретен ия

Способ обнаружения зндотоксинов . грамотрицательных бактерий путем применения флюоресценции антител к Re-гликолипиду, о т л и ч э ю шийся тем, что, с целью

15 повышения чувствительности и упрощения способа, исследуемую пробу смешивают с кровью, из смеси готовят мазок, который вначале обрабатывают плазмой или сывороткой крови неиммунолизировэнных жи20 вотных, а затем флюоресцирующими антителами к Re-глйколипиду и по наличию ярко светящихся полиморфно-ядерных лейкоцитов судят о присутствии эндотоксина в исследуемой пробе.