Способ определения антител к антигену вируса гепатита дельта

 

Использование: вирусология, иммунология , иммунохимия; Сущность изобретения: радиойодирование антител к антигену вируса гепатита дельта (антидельта) проводят путем последовательного смешивания растворов Na J, хлорамина Т из расчета

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 (21) 4846555/13 (22) 28.06.90 (46) 30,07.92.Бюл. М 28 (71) Хозрасчетное опытное предприятие

"Радиопрепарат" Института ядерной физики АН УЗССР (72) А.С.Щеголев, А.М.Алимаксумов, Т,В,Голованова, С.О.Вязов, В.А.Ананьев и М.Абдукаюмов (56) АВВОТТ anti-DELTA. lnstructoin Manual.

ABB0TT Laboratories, 1986.

Rlzzetto М., Shin J.Ì.-K„and Gerin 3Л, The hepatitis В virus-associated delta

antigen: isolation from liver, development of

solid-phase radlolmmunoassays for delta

antigen and anti-delta and partial characterization of delta antigen, — J. Immunol., ч, 125, М1, р. 3l8 — 324, 1980, Вазыховой Ф.Г. Радиоиммунный метод определения маркеров дельта-инфекции и

его применение для анализа полипептидного состава дельта-анти гена/Дис. на соискание ученой степени. Институт вирусологии им, Д.И.Ивановского, АМН СССР, °

N- 1988.

Изобретение относится к вирусологии, иммунологии и иммунохимии и может быть использовано для изготовления радиоиммунологической тест-системы для диагностики гепатита дельта.

Известны способы определения антител к антигену вируса гепатита дельта (антидельта), включающие выделение дельта-антигена, и антидельта, изготовление твердой фазы — пробирок, сенсибилизированных дельта-антигеном или антидельта, радиойодирование антидельта (изготовление J-антидельта) и постановку радиоиммуноанализа в конкурентном или неконкурентном варианте.

„„!Ы„„1751681 А1 (я)5 G 01 N 33/576, 33/53

":11 09, 2 %

2 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К

АНТИГЕНУ ВИРУСА ГЕПАТИТА ДЕЛЬТА (57) Использование: вирусология, иммунология,. иммуйохймйя ."Сущность изобретения, радиойодирование антител к антигену вируса гепатита дельта (антидельта) проводят путем последовательного смешивания растворов Na J, хлорамина Т из расчета

125 (0,1 — 0,5) 10 гхлораминаТна1мКийа .1 и раствора антидельта, При постановке радиоиммунологического анализа исследуемые образцы вносят одновременно с препаратом дельта-энтигена. Способ используется для создания набора реактивов для радиоиммунологического анализа антител к антигену вируса гепатита дельта.

3 табл.

° авек

Однако способы. предусматривающие сенсибилизацию пробирок дельта-антиге- 0 ном, предполагают большой расход дефицитного (ввиду труднодоступности его источника) препарата дельта-антигена и высокую степень его очистки, что удорожает изготовление компонентов тест-системы и приводит к продолжительному контакту персонала лаборатории с высокопатогенным материалом, а способы, предусматривающие изготовление твердой фазы на основе антидельта, не обеспечивают высокой чувствительности анализа.

Наиболее близким к предлагаемому является способ, включающий выделение

1751681 дельта-антигена из постмортальной ткани печени больных хроническим гепатитом дельта людей экстракцией гомогената печени, выделение антидельта из сыворотки крови больных гепатитом дельта хроматографией на сефадексе ДЕАЕ А-50. сенсибилизацию пробирок раствором антидельта, радиойодирование антидельта по классической методике с применение хлорамина Т, постановку радиоиммунологического анализа по следующей схеме; внесение в пробирки дельта-антигена; инкубация; промывка; внесение в йробирки исследуемых образцов; инкубация; промывка; внесение в пробирки J-антидельта; инкубация; 125 промывка; измерение связавшейся с пробирками радиоактивности; оценка результатов анализа, - Известный способ обладает достаточной специфичностью и не требует высокой степени очистки дельта-антигена, однако он характеризуется трудоемкостью постановки анализа(3 операции внесения реактивов, 3 инкубации, 3 отмывки) и относительно большим расходом дефицитного (ввиду труднодоступности источника выделения) препарата дельта-антигена. Кроме того, изготовленная на основе известного способа тест-система уступает по чувствительности лучшим мировым образцам.

Целью изобретения является упрощенйе методики постановки радиоиммунологического анализа, экономия труднодоступного препарата дельта-антиге- на и увеличение чувствительности способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу включающему выделение

/ дельта-антигена из постмортальной ткани печени, выделение антител к энтигену вируса гепатита дельта (антидельта) из сыворотки крови больных хроническим гепатитом дельта, изготовление твердой фазы — сенсибилизированных антидельта пробирок, радиойодирование антидельта с применением хлорамина Т и постановку радиоиммуйологического анализа, радиойодирование антидельта проводят путем, последовательногосмешивания раствора Na J. хлорамина Т из расчета(0,1 — 0,5) 10 гхлорамина

Т на 1 мКи Na J и раствора антидельта, а при постановке радиоиммунолагического анализа исследуемые образцы вносят одновременно с препаратом дельта-антигена..

Предлагаемый способ отличается от известных последовательностью внесения реагентов в реакционную смесь при проведении радиойодирования, экспериментально подобранным для данной последовательности операций соотношением количества хлорэмина Т и радиоактивного материе 1э (0,1 10 — 0,5 10 r хлорэмина

Т на 1 мКи Na125J) и методикой постановки радиоиммуноанал иза — одновременным внесением в реакционные пробирки анализируемых образцов и дельта-антигенэ и совместной их инкубацией с твердой фазой.

Предложенная последовательность внесения реакторов в реакционную смесь (Na J + хлорамин Т+ белок), существенно

10 отличающаяся от традиционной схемы ра-. диойодирования с применением хлорэминэ

Т (белок Na J 1- хлорамин Т) при экспе125 риментально подобранном соотношении количества хлорамина Т и радиоактивного

15 материала(0,1 10 — 0,5 . 10 r хлорэмина

Т нэ 1 мКи Na J), приводит к увеличению

125 чувствительности способа в 1.5 — 5 раз (табл.

1), При использовании хлорамина Т в количестве менее 0 1 . 10 r или более 0,5 108

20 г на 1 мКи Na J выигрыш в чувствительности от реализации данной схемы рэдиойодирования теряется (табл, 2).

Кроме того, достигнутый выигрыш в чувствительности не теряется при постановке

25 радиоиммуноанализа по предложенной схеме, включающей одновременное внесение в пробирки исследуемых образцов и раствора дельта-энтигена и их совместную инкубэцию с твердой фазой. Таким обрэ30 зом, методика постановки радиоиммуноанализа существенно упрощается: новая схема предполагает две операции внесения реактивов в пробирки, две инкубации, две отмывки взамен трех операций внесения, 35 трех инкубаций и трех отмывок по прототипу.

Предложенная схема постановки радиоиммуноанализа обеспечивает также. уменьшение расхода труднодоступного

40 препарата дельта-энтигена. Оптимальная чувствительность предложенного способа достигается при использовании для постановки радиоиммуноанализа разведенного в

100 раз препарата дельта-антигена (табл. 3), 45 При этом по предложенной схеме нэ одно определение расходуется 50 мкл разведенного препарата, По прототипу тот же самый препарат дельта-антигена разводится для постановки анализа в 50 раз, причем расход

50 разведенного препарата на одно определение составляет 100 мкл, Следовательно, при реализации предлагаемого способа достигается четырехкратная зкономия дельта-энтигена на одно определение по сравнению

55 с прототипом.

Таким образом, проведение рэдиойодирования анти-дельта путем последовательногосмешивания раствора Na J, раствора хлораминаТиз расчета(0,1-0,5) 10 гхло1751681 на

25

40

55 рамина Т на 1 мКи Na J и раствора анти125 дельта, а также внесение в пробирку при постановке радиоиммуноанализа раствора дельта-антигена одновременно с исследуемыми образцами обеспечивают увеличение чувствительности способа в 1,5-5 раз, упрощение методики поставки радиоиммуноанализа и четырехкратную экономию труднодоступного препарата дельта-антигена, Способ реализуют следующим образом, Пример 1. Выделение дельта-антиге4 r печени погибшего больного хроническим гепатитом дельта заливали 20 мл буферного раствора (состав, М: гуанидинхлорид 6; NaCI 0,15; ЭДТА 0,025; трис-HCI

0,05; рН 7,5), гомогенизировали 10 мин в гомогенизаторе Поттера и центрифугировали гомогенат в течение 30 мин при 100009, Надосадочную жидкость сливали и использовали как препарат дельта-антигена, Выделение антидельта, 5 мл сыворотки крови больного хроническим гепатитом дельта (РИА титр антидельта 1:200000) диализовали в теченйе 24 ч против 0,01 М фосфатного буфера рН 8,0.

Раствор осветляли центрифугированием (10000g, 5 мин) и наносили на колонку с сефадексом ДЕАЕ А-50 обьемом 20 мл, уравновешенную 0,01 М фосфатным буфером рН 8,0. Элюцию проводили тем же буфером. Оптическую плотность элюата регистрировали проточным денситометром

Оч!согд Sll на длине волны 280 нм, Фракции, соответствующие пику оптической плотности, объединяли и диализовали против физиологического раствора, забуференного 0,01 М трис-HCI рН 7,5, Концентрация белка в растворе, определенная спектрофотометрически с использованием соотношения С(мг/мл)=ОД 280/1,35, составила 0,75 мг/мл.

Изготовление твердой фазы — пробирок, покрытых антидельта.

Выделенный препарат антидельта разводили 0,2 М карбонатным буфером рН 9,5 до конечной концентрации 5 мкг/мл и вносили порциями по 150 мкл в полиэтиленовые пробирки вместимостью 1,5 мл, Пробирки выдерживали в течение ночи при комнатной температуры, удаляли раствор, трижды промывали пробирки дистиллиро-. ванной водой и высушивали при комнатной температуре.

Радиойодирование антидельта (изготовление J-антидельта)

В коническую пластмассовую пробирку вместимостью 1,5 мл помещали 1,5 мКи

Na J в объеме 5 мкл; добавляли 5 мкл

125 раствора хлорамина Т с концентрацией 0,5 мкг/мл, перемешивали, выдерживали 30 с и вносили в смесь 60 мкл раствора энтидельта с концентрацией 0,75 мг/мл, Реакционную смесь тщательно перемешивали. выдержи-. вали 5 мин и наносили на колонку с сефадексом 6-25 Modlum объемом 15 мл, уравновешенную 0,05 М трис-HCI рН 7,5

Элюцию проводили тем же буфером. Собирали фракции объемом по 0,5 мл. Фракции, соответствующие первому пику радиоактивности J по прибору ДРГДА — 1, объединя125 ли и разбавляли буфером (состав: 0,01 М трис-HCI рН 7,5; 0,14 М NaCI; 3% бычьего сывороточного альбумина: 5% сыворотки человека, не содержащей маркеров вируса гепатита дельта; 0,1% твин-20; 0,001% Бааз до обьемной активности 75 кБк/мл, Постановка радиоиммунологического анализа.

В 4 сенсибилизированные антидельта пробирки вносят по 50 мкл отрицательного контроля (сыворотка крови человека, заведомо не содержащая маркеров вируса гепатита дельта), в 2 пробирки — по 50 мкл положительного контроля (сыворотка крови больного хроническим гепатитом дельта), в остальные пробирки — no 50 мкл неизвестных сывороток для анализа. Затем во все пробирки добавляют по 50 мкл разведенного в 100 раз буферным раствором (состав:

0,14 M NaCI; 0,01М трис-HCI рН 7,5; 0,1% твин-20; 0,5% бычьего сывороточного альбумина) препарата дельта-антигена и перемешивают легким встряхиванием пробирок.

Выдерживают пробирки в течение ночи при комнатной температуре.

Удаляют содержимое пробирок и трижды промывают их дистиллированной водой, Вносят во все пробирки по 100 мкл препарата J-антидельта с объемной эктивно125 стью 75 кБк/мл.

Выдерживают пробирки в течение 4 ч при комнатной температуре;

Удаляют содержимое пробирок и пятикратно промывают их дистиллированной водой.

Связавшуюся с пробирками радиоактивность J измеряли при помощи однока125 нального ядерного спектрометра NP — 420L, Результаты анализа расценивали как значимые, если отношение среднего счета (за вычетом фона счетчика) положительных и отрицательных контролей было не менее 5.

Положительными в данном тесте (т.е. содержащими антидельта) считали сыворотки, счет связавшейся. радиоактивности которых превышал полусумму средних значений сче1751681 та положительных и отрицательных контролей.

Относительная чувствительность реализованного таким образом способа составила 1:2000. 5

Под чувствительностью метода принято понимать минимальное достоверно выявляемое данным методом количество вещества. Однако отсутствие общепринятого международного стандарта антидельта де- 10 лает прямое количественное определение чувствительности невозможным. Поэтому для сравнения различных тест-систем и способом определения антидельта по чувствительности (способ = тест-система + ме- 15 тодика постановки анализа), относительная чувствительность определялась как максимальное достоверно положительное в анализе разведение одной и той же сыворотки больного хроническим гепатитом дельта. 20

Таким образом, полученные значения разведений применимы только для сравнения по чувствительности описанных тест-систем и способов между собой.

Пример 2. Осуществляли способ по 25 прототипу, за исключением этапа радиойодирования антидельта. Радиойодирование антидельта проводили, как описано в примере 1, Определяли относительную чувствительность изготовленных таким способом 30 тест-систем и тест-систем, изготовленных по прототипу (постановка радиоиммуноанализа при определении относительной чувствительности в обоих случая проводилась по . прототипу). 35

Полученные результаты приведены в табл. 1.

Пример 3. Осуществляли способ по прототипу, за исключением этапа радиойодирования антидельта; Радиойодирование 40 антидельта проводили, как описано в примере 1, при этом концентрацию добавляемого раствора хлорамина Т варьировали от

50 до 0,05 мкг/мл. Таким образом, количество вносимого в реакцию хлорамина Т на 1 45 мКи Na J варьировалось от 0,25 10 до

0,25 10 г. Определяли относительную: чувствительность изготовленных тест-систем. Постановку радиоиммуноанализа при определении относительной чувствительности проводили по прототипу, Полученные результаты приведены в табл. 2.

Пример 4, Определяли относительную чувствительность способа, реализуемого по примеру 1, при различных разведениях вносимого в пробирку на первой стадии постановки радиоиммуноаналиэа препарата дельта-антигена.

Результаты приведены в табл, 3, Таким образом, проведение радиойодирования антидельта путем последовательного смешивания растворов Na J, 125 раствора хлорамина в определенном количестве и раствора антидельта, а также одновременное внесение препарата дельта-антигена с исследуемыми образцами при постановке радиоиммунологического анализа обеспечивают увеличение чувствительности способа в 1,5-5 раз, при этом упрощается методика за счет сокращения количества операций, а также четырехкратной экономии труднодоступного препарата дельта-анти гена, Формула изобретения

Способ определения антител к антигену вируса гепатита дельта, включающий выделение дельта-антигена из постмортальной ткани печени, выделение антител к антигену вируса гепатита дельта (антидельта) из сыворотки крови больных хроническим гепатитом дельта, изготовление твердой фазы— сенсибилизированных антидельта пробирок, радиойодирование антидельта с применением хлорамин Т и постановку радиоиммунологического анализа, о т л ич а ю шийся тем, что, c целью увеличения чувствительности способа, упрощения методики постановки радиоиммунологического анализа и экономии препарата дельта-антигена, радиойодирование антидельта проводят путем последовательного смешивания растворов Na J, хлорамина Т . из расчета (0,1-0,5) 10 г хлорамина Т на 1 мКи Ne J и раствора антидельта, а при

125 постановке радиоиммунологического анализа исследуемые образцы вносят одновременно с препаратом дельта-антигена, 1751681

Таблица l

Относительная чувствительность тест-систем при различных методах получения J-антидельта

125

Таблица 2

Относительна чувствительность тест-систем при проведении радиойодирования по предлагаемому способу с вариацией количества вносимого в реакцию хлорамина Т на мКи Na J

Таблица 3

Относительная чувствительность предлагаемого способа определения антидельта в зависимости от разведения препарата дельта-антигена, вносимого в пробирку на первой стадии постановки радиоиммуноанализа.

Составитель Л.Панфилова

Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор Т.Вашкович

Редактор А,Лежнина

Заказ 2688 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101