Способ получения антирабического иммуноглобулина

 

Использование: медицина, производство иммуноглобулина. Доноров 0(1) и А(И) групп крови иммунизируют антирабической вакциной, выделяют из плазмы крови иммуноглобулин , очищают его методом диафильтрации на плоскорамных фильтрах, заправленных полиамидными мембранами на подложке типа УПМ-И и лиофилизуют. Полученный антирабический иммуноглобулин обладает высокоспецифической активностью и содержит вируснейтрализующие антитела в титре не менее 1 50 000. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАР СТВЕ ННЫ Й КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ASTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4852152/14 (22) 18.07,90 (46) 07.07,92; Бюл. N 25 (71) Киевский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови (72) Е.А. Федоровская, А.П. Рыбальская, M.À. Селимов. В,Ф, Соболев, А.А. Шинкаренко и В,П. Логвинова (53) 612.015(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

N 1258417, кл. А 61 К 39/205, 1986.

Изобретение относится к области медицины, а именно к производственнойтрансфузиологии, и предназначено для получения высокоэффективного, длительно сохраняющегося антирабического иммуноглобулина для профилактики и лечения гидрофобии.

Известны способы получения иммуноглобулинов направленного действия; антистафилококкового, противогриппоэного, противостолбнячного, противосинегнойного и др. Известны также способы получения антирабического иммуноглобулина. В основе этих способов лежит иммунизация соответствующими антигенами и выделение иммуноглобулина из плазмы крови.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является способ получения антирабического иммуноглобу- лина человека, который предусматривает внутримышечное введение донорам концентрированной культуральной антирабической вакцины (КОКАВ) иэ вирусного

„„Я3„„ 1745257 А1 (si)s А 61 К 39/205, G 01 и 33/531 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА (57) Использование: медицина. производство иммуноглобулина. Доноров 0(l) и A(ll} групп крови иммунизируют антирабической вакциной, выделяют из плазмы крови иммуноглобулин, очищают его методом диафильтрации на плоскорамных фильтрах, заправленных полиамидными мембранами на подложке типа УПМ вЂ” Il и лиофилизуют.

Полученный антирабический иммуноглобулин обладает высокоспецифической активностью и содержит вируснейтрализующие антитела в титре не менее 1:50 000. 1 табл. штамма Внуково 32 — 107, в дозе 1,5 мл на 1, 30, 90 сут, Способ позволяет получить аллогенный антирабический иммуноглобулин с титром вируснейтрализующих антител

1:2430 — 1:7290.

Однако техническое решение имеет следующие недостатки: длительность интервалов между введениями вакцины, практически неприемлемая для донорства; большой разброс титров вируснейтрализующих антител (ВНАТ) в сыворотке крови вакцинируемых, в связи с отсутствием целенап равленного подбора контингента доноров, что в свою очередь приводит к получению препарата с нестандартным диапазоном титров в различных сериях; получение препарата в жидкой лекарственной форме (в виде 10% раствора), что сокращает срок его хранения, создает неудобство при транспортировке в очаги эпизООтии.

Целью изобретения является повышение специфической активности, стабильно1745257

30

55 сти и удлинение сроков хранения аллогенного антирабического иммуноглобулина для внутримышечного введения.

Поставленная цель достигается целенаправленным подбором доноров для иммунизации КОКАВ, относящихся к 0(l), A(ll) группам крови по системе АВО, специально отработанной схемой иммунизации, выделением р-глобулиновой фракции из плазмы крови с последующей ее очис-,кой методом диафильтрации на плоскорамных фильтрах, заправленных полиамидными мембранами на подложке типа УПМ II, и лиофилиэацией препарата на конечном этапе.

Отличительными признаками изобретения являются подбор доноров О(() и A(II) групп крови.для иммунизации, высокореагирующих на введение антирабической вакцины, результаты наблюдений свидетельствуют о значительно более низком уровне специфического иммунного ответа доноров В (ill) и АВ (IV) групп крови; отбор плазмы крови доноров с высоким содержанием вируснейтрализующих антител. Титр

ВНАТ определяется в параллельных исследованиях реакции нейтрализации на белых беспородных мышах и в иммуноэнзиматическом тесте; очистка у -глобулиновой фракции методом диафильтрации нэ плоскорамных фильтрах с полиамидными мембранами на подложке типа УПМ вЂ” II.

Совокупность отличительных признаков дала возможность разработать способ. получения аллогенного антирабического иммуноглобулина в лиофилизированном виде с высоким титром ВНАТ.

Сущность изобретения характеризуется конкретными примерами исполнения.

Пример1. Донор И. Группа крови О(1).

Введение концентрированной культуральной антирабической вакцины в количестве

1,0 мл проводят с соблюдением строгих правил асептики и антисептики в верхний наружный квадрант ягодицы на 0, 7, 15, 30 сут.

На 45 сут в сыворотке крови донора определяют титр BHAT в реакции нейтрализации на белых беспородных мышах и в иммуноэнзиматическом тесте, Результат определения:

1:810. Плазму крови, изъятую методом плаэмафореза фракционируют спиртовым способом в соответствии с действующим регламентом производства 10-16% раствора гамма-глобулина иэ донорской плазмы, Фракционирование иммунной антирабической донорской плазмы проводили по методу Кона в соответствии с регламентом производства раствора гамма-глобулина из донорской плазмы. Для этого осадок белков фракции II+III содержащий гамма-глобулиновую фракцию. выделяют в соответствии с регламентом производства 5, 10 и 20% альбумина, Затем проводят переосаждение белков фракции II+III. Осадок фракции II+III, хранившийся не более трех месяцев при температуре не выше — 20 С, растворяют в предварительно охлажденном до 0 физиологическом растворе из расчета 7,5 обьемов физиологического раствора по отношению к весу осадка, Суспенэию загружают в стеклянный сосуд. помещенный в фракционнь:й стол, при температуре спирта большой ванны-1+" 1, С, Суспензию,при постоянном помешивании охлаждают до 0" и перемешивают при этой температуре еще два часа. Затем температуру спирта большой ванны фракционного стола понижают до (— 5) -(— 6) С. Су= пензию охлаждают до температуры — 1ЯС. Б мерник медленно заливают предварительно охлажденный до — 15 — -20 С 95% этиловый спирт в количестве 240 мл на 1 л суспензии. Конечная концентрация спирта в смеси 19%.

Смесь перемешивают не менее двух часов при температуре (— 5) — (-6) С (созревание осадка), Затем осадок отделяют центрифугированием в стаканчиковых рефрижераторных центрифугах при температуре (— 5) — (— 6) С и 2700-3000 об/мин в течение 30 мин. Осадок собирают в закрытую емкость и взвешивают, хранят при температуре (— 35) — (— 50) С йе более одного месяца, Получение осадка гамма-глобулина.

Центрифугат загружают в стеклянный сосуд, помещенный во фракционный стол при температуре спирта большой ванны (— 5) — (— 6) С. К раствору добавляют 5 М раствор хлористого натрия из расчета 10 мл на каждый литр центрифугата, устанавливают рН

7,0 — 7,2 путем добавления 4,2% раствора бикарбоната натрия. Затем иэ мерника добавляют охлажденный до температуры (— 15)— (— 20)0С 95% этиловый спирт иэ расчета 160 мл на 1 литр смеси. Конечная концентрация спирта в смеси 26%, Затем смесь перемешивают не менее двух часов, центрифугируют при температуре (-5) — (— 6) С, 2700-3000 об/мин в течение 30 мин и выделяют фракцию!! (осадок В), Выделенную фракцию II (осадок В) суспендируют в охлажденном 0,9% растворе поваренной соли в соотношении вес/обьем 1:2.

Концентрация белка в суспензии составляет

5,0 — 5,5%. Смесь оставляют на длительное время(додвух месяцев)для отстаивания. По истечении этого времени отстоявшуюся жидкость пропускают через мезгу, и освет1745257

15

30

55 ленный раствор подвергают диафильтрации, которую проводят на плоскорамных фильтрах, заправленных полиэмидными .мембранами на подложке типа УПМ II.

Продолжительность очистки 10 литров

5 раствора гамма-глобулина на этой установке составляет 4 ч, Очищенный от низкомолекулярных примесей раствор пропускают через стерилизующие фильтры и разливают в ампулы для лиофилизации.

Пример 2.Донор П, Группа крови A(ll), КОКАВ вводили в дозе 1,0 мл по схеме О, 7, 15, 30 сут. На 45 сут определяли титр В НАТ.

Результат определения-титр BHAT 1:516.

Иммуноглобулин получали аналогичным способом.

Пример 3. Донор С„Группа крови

B(IIi), КОКАВ вводили в дозе 1,0 мл по схеме.

0,7,15,30 сут, На 45 сут определяли титр

ВНАТ. Результат определения — титр ВНАТ

1:30, Плазма не пригодна для получения антирабического иммуноглобулина.

Пример 4. Донор К. Группа крови АВ (И). Проведена внутримышечная иммунизация КОКАВ в дозе 1,0 мл по схеме О, 7, 15, 30 сут. На 45 сут определяли титр ВНАТ.

Результат определения — титр ВНАТ 1:45,5.

Плазма не пригодна для получения антирабического иммуноглобулина.

Целевой продукт, полученный в лиофилизированном виде, характеризуется титром ВНАТ 1:54 000.

Результаты распределения уровня

ВНАТ с учетом групповой принадлежности сывороток крови представлены в таблице.

Таким образом, согласно изобретению, разработан способ получения лиофилизированного аллогенного антирабического иммуноглобулина с титром вируснейтралиэующих антител не менее чем 1:50 ООО, Сухой препарат антирэбического иммуноглобулина выпускается в запаянных ампулах и представляет собой таблетку или порошок кремоватого цвета, Предлагаемый способ позволяет получить быстрорастворимый антирабический иммуноглобулин, который хранится при 1822 С и не требует специальных условий при транспортировке в очаги эпизоотий, не подвертается фрагментации в процессЕ хранения, безвреден для организма и пригоден для внутримышечного введения. Сухой иммуноглобулин термостабилен (выдерживает после растворения прогрев при57 С втечение 4 ч), не имеет остаточного спирта, что также исключает денатурацию белка при. хранении.

Воспроизведение способа доступно для производства препаратов крови в условиях заводов бакпрепаратов, станций переливания крови, производство экономически оправдано, не требует специального оборудования. Данный препарат крайне необходим для практического ",дравоохранения.

Пример 5, Стабильность препарата.

Лиофилизированный аллогенный антирабический иммуноглобулин после двух лет хранения при t 16 — 22 С сохранял исходную специфическую активность и физико-химические свойства. Срок годности препарата определяли также при хранении препарата в течение 1 мес при температуре +37 С.

Даннйй метод применяется для изучения стабильности иммунных препаратов различной направленности и предусматривает, что условия хранения в течение трех лет при температуре (+2)-(+10) С равны одному году при температуре (+ I8)-(+22) С и равноценны хранению в течение одного месяца при температуре +37 С.

Результаты исследований свидетельствуют о сохранении специфической активности антирабического донорского иммуноглобулина в титре 1:31180 после хранения при 37 С один месяц, что соответст25 вует 442 МЕ. В то же время известно, что коммерческие препараты донорского иммуноглобулина, применяемые за рубежом с лечебной и профилактической. целью, имеют специфическую активность 150 МЕ.

Таким образом, целевой продукт полностью пригоден к применению в результате двух лет хранения при t (+16) — (+22) С и последующего хранения при t+37 С один месяц, что в общей сложности соответствует трем годам хранения при t (+16) — (+22) С или примерно девяти годам хранения при температуре +4 С, Формула изобретения

Способ получения антирабического иммуноглобулина путем внутримышечного введения концентрированной культуральной антирабической вакцины КОКАВ донорам с последующим выделением целевого продукта из плазмы крови, о т л и ч э ю щ и йс я тем, что, с целью повышения специфической активности целевого продукта, его стабильности и удлинения сроков хранения, вакцину вводят донорам О(1) и А (II) групп крови в объеме 1,0 мл на О, 7, 15, 30 сутки. выделенную из плазмы крови гамма-глобулиновую фракцию отстаивают, подвергают диафильтрации на плоскорамных фильтрах, заправленных полиамидными мембранами на подложке типа УПМ-1, и полученный целевой продукт лиофилиэируют, 1745257

P — сравнение проведено по отношению к 0(l) и А (! 1) группам крови.

Составитель А,Агуреев

Редактор И,Ванюшкина Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Т.Палий

Заказ 2340 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101