Способ определения концентрации пчелиного маточного молочка в фармацевтических препаратах и медопродуктах

 

Использование: химические способы контроля количества нативного маточного молочка (апилака) в фармацевтических и пищевых продуктах. Сущность изобретения: содержащие маточное молочко препараты растворяют в растворе щелочи, добавляют 30%-ный пероксид водорода затем через 15-60 с-1%-ный раствор сульфата меди до появления опалесценции. Полученную смесь центрифугируют и фотометрируют на длинах волн 556 и 680 нм. По формуле находят концентрацию специфического белка, маточного молочка в анализируемом продукте.Т табл. XI XI О СА) СЛ

СОЮЗ СОВЕ ГСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 6 01 N 33/02

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

Ф

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ I ":

К ПАТЕНТУ

4 о

6д

Ql (21) 4899781/13 (22) 08.01.91 (46) 15.11.92. Бюл. № 42 (75) А. Д, Рошаль, B. А. Чуйкои В. В. Мамонтов (73) Республиканская лаборатория контроля качества меда и медопродуктов лечебнои рофилактического питания (56) Фармакопейная статья N 42 — 429 — 72, Биологический метод определения количества маточного молочка.

Свобода Я., Махова М„ Бацилек Я. Определение количества и качества маточного молочк- в меде, Продукты пчеловодства; пища, здоровье, красота. Бухарест; Апимондия, 1988, с, 48.

Временная фармакопейная статья № 42—

1289-83. Количественное определение, с. 3.

Младенов С, Мед и медолечение. Кишинев, Штинница, 1984, с. 166 — 168.

Авторс:.-oe свидетельство

¹ 1167501. кл, G 01 N 33/04, 1985.

Авторское свидетельство СССР

¹ 1254386, кл. G 01 N 33/48, А 61 В 10/00, 1986.

Авторское свидетельство СССР

¹ 1383201, кл. G 01 N 33/02, 1988.

Бернштейн И, Я., Кминский Ю. Л. Спектрофотометрический анализ в органической химии, Л.; Химия, 1986, с. 58 — 64, Изобретение относится к химическим способам контроля количества нативного маточного молочка (далее апилака) в фармацевтических и пищевых продуктах.

Изобретение может быть использовано для определения маточного молочка в биологически активных медопродуктах, содержащих повышенные концентрации апилака, „.,!Ж„„1776351 А3 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ПЧЕЛИНОГО МАТОЧНОГО МОЛОЧКА

В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТАХ И

М ЕДО ПРОДУКТАХ (57) Использование: химические способы контроля количества нативного маточного молочка (апилака) в фармацевтических и пищевых продуктах, Сущность изобретения: содержащие маточное молочко препараты растворяют в растворе щелочи, добавляют

30%-ный пероксид водорода затем через

15 — 60 с — 1 -ный раствор сульфата меди до появления опалесценции. Полученную смесь центрифугируют и фотометрируют на ..ъ длинах волн 556 и 680 нм. По формуле находят концентрацию специфического белка, маточного молочка в анализируемом продукте.7 табл. а также в лекарственных апилаксодержащих препаратах — таблетках, эмульсиях, свечах.

Известен способ контроля количества маточного молочка биологическим методом. включающий инкубацию однодневных пчелиных личинок в течение 6 дней при температуре 35:И С и влажности 96 1, 1776351

25

45

55 периодическое внесение анализируемого продукта и измерение прироста массы и количества выживших личинок. Недостатки этого способа заключаются в его низкой точности, большой продолжительности анализа, применимости его лишь для чистого апилака или препаратов, преимущественно .содержащих апилак. Кроме того, анализ можно проводить лишь в весенне-летний период, когда есть возможность работы с личинками.

Известен также способ контроля количества маточного молочка по содержанию в нем пантотеновой кислоты, включающий анализ последней микробиологическими методами с использованием культур Sacharomycea, Streptococcus, Lactobacillus,Serratla. Способ обладает низкой точностью, а также не применим для анализа медопродуктов,, так как мед сам по себе содержит значительные количества пантотеновой кислоты.

Известен также способ контроля количества маточного молочка в медопродуктах, включающий маркирование вводимого в продукт апилака глюконатом кальция, последующий анализ медопродукта путем ионообмен ного концентрирования маркера и комплексонометрического титрования ионов кальция в концентрате. Недостатком этого способа является необходимость маркировать апилак прямо в процессе производства, что технологически неудобно.

Маркирование отдельных проб значительно усложняет анализ и не применимо при массовых определениях.

По технической сущности и достигаемому эффекту наиболее близким к предлагаемому является способ контроля количества маточного молочка по содержанию 10-окси2-деценовой (деценоевой) кислоты, включающий трехкратную экстракцию апилака или апилаксодержащих продуктов диэтиловым эфиром, трехкратную реэкстракцию эфирных извлечений 1Й водным раствором

NaOH, подкисление щелочного раствора

50 -ной серной кислотой до рН 1, нейтрализацию серной кислоты гидрокарбонатом натрия до рН 8, трехкратную промывку полученного раствора диэтиловым эфиром, повторное подкисление раствора до рН1, трехкратное извлечение деценоевой кислоты дизтиловым эфиром, промывку эфирного экстракта водой, сушку его безводным сульфатом натрия, упаривание досуха и обратное титрование сухого остатка в 0,01N

NaOH 0,01N-ным раствором серной кислоты в присутствии фенолфталеина. Количество оттитрованной деценоевой кислоты должно составлять не менее 5 -,ь в пересчете на сухое маточное молочко.

Недостатки прототипа заключаются в следующем:

Способ включает в себя девять процедур экстракции и две процедуры промывки, т,е. является черезвычайно трудоемким.

Многократное экстрагирование, сопровождающееся на каждом этапе небольшими потерями анализируемого вещества. в конечном итоге приводит к значительному раэбросу результатов, снижению чувствительности и точности способа.

В процессе осуществления способа неоднократно изменяется кислотность экстрактов, Это необходимо для очистки деценоевой кислоты от кислых и основных примесей. Помимо достоинства использование скачкообразных изменений рН имеет и ряд недостатков, проявляющихся на последней стадии обратного кислотно-основного титрования. При наличии остатков серной кислоты в эфирном экстракте, при недостаточных его сушке и промывке, при неполном упаривании результаты титрования искажаются, содержание деценоевой кислоты эавышается. Во всех последующих после изменения рН процедурах необходим строгий контроль кислотности, что дополнительно усложняет анализ.

Кроме деценоевой кислоты в апиалке содержатся и другие органические кислоты, в частности 48-125 мгlг (4,8 — 12,5. ) никотиновой и 180-200 мг/г (18-207;) пантотеновой кислот (4). Эти кислоты могут экстрагироваться эфиром, растворами щелочей и оттитровываться вместе с деценоевой кислотой, завышая результаты анализа, В процессе осуществления способа приходится работать с токсичным растворителем — диэтиловым эфиром, поэтому для проведения анализа необходимо создание специальных условий работы.

Цель изобретения — повышение точности и снижение трудоемкости способа, сокращение времени осуществления и расширение его функциональных возможн остей.

Поставленная ель достигается тем, что в известном способе, включающем извлечение из анализируеМого продукта компонента, характерного для маточного молочка, Определение количества этого компонента и пересчет его на содержание молочка в анализируемом продукте. согласно изобретению, в качестве анализируемого компонента используют специфический белок маточного молочка, который количественно анализируют путем его растворения в 1,05,G н. растворе NaOH, добавления 25-300 мкл 30 ного пероксида водорода и через

15-60 с — 1 -ного раствора СиЗОд, необхо1776351

40

50 димом для появления опалесценции, центрифугирования и фотометрирования надосадочной жидкости на длинах волн 556 и

680 нм и расчета количества специфического белка маточного молочка по концентрации образованного им комплекса с ионами меди, Согласно заявляемому способу продукт, содержащий маточное молочко, растворяют в 1,0 — 5,0 н. растворе NaOH, добавляют 25-300 мкл Н202 и через 15 — 60 с

1ф,-ный раствор CuS04 в объеме, необходимом для появления слабой мути — опалесценции смеси, Опалесценцию удаляют центрифугированием, полученный прозрачный раствор, содержащий комплекс меди и специфического белка маточного молочка, фотометрируют на длинах волн 556 и 680 нм, Затем, зная содержание этого белка в маточном молочке находят количество последнего в анализируемом. продукте.

Предлагаемый способ имеет следующие признаки, отличные от прототипа.

В качестве анализируемого компонента, содержащегося в маточном молочке и отсутствующего в меде и наполнителях(при анализе лекарственных средств), в предлагаемом способе использован белок, имеющий в своем составе высокие концентрации гидроксиаминокислот серина и треонина и .образующий специфически окрашенные комплексы с солями меди.

В отличие от используемой в прототипе деценоевой кислоты анализируемый белок: содержится в маточном молочке в количестве, в 2-3 раза превышающем концентрацию деценоевой кислоты. Это позволяет уменьшить навески дефицитных лекарственных препаратов и медопродуктов, не снижая чувствительности анализа; обладает большей устойчивостью и позволяет определять количество маточного молочка в медопродуктах, лекарствах и продуктах лечебно-профилактического питания в процессе их длительного хранения; позволяет установить фальсификацию маточного молочка, так как подобрать белок-заменитель, образующий медьсодержащий комплекс с характерным соотношением коэффициентов молярного погашения на длинах волн 556 и 680 нм, практически очень трудна.

Способ прототипа не является селективным к деценсевой кислоте: ее можно заменить любой насыщенной С --С1о-карбоновой кислотой, оксикислотами или ниацином.

Количество белка определяют по интенсивности окраски его комплекса с ионами меди путем растворения ап лаксодержащего продукта в 1.0 — 5,0 н,растворе йаОН, добавления 25-300 мкл 30;ь-ного Н О2 и через

15 — 60 с 1ф,-ного CuS04 в объеме, необходимом для образования опалесценции: анализируемый белок образует с реагентом HzOz+CuSO4 специфическую красно-фиолетовую окраску с основным максимумом поглощения — 556 нм и соотношением коэффициентов молярного погашения Eна/ а о=0,483 +.0,004. Другие белки меда, маточного молочка, пыльцы образуют с ионом Си комплексы, имеющие

Q»=630 — 680 нм и ебаО/ 6556=-1,219 0,008.

Благодаря этим спектроскопическим отличиям обеспечивается достаточно высокая селективность и, соответственно, большая точность анализа.

Определение белка маточного молочка возможно в присутствии других "чужерод-. ных" белков, а также аминокислот. что расширяет функциональные возможности способа.

В прототипе деценоевая кислота определяется косвенным способом — путем кислотно-основного титрования, т.е. путем определения концентрации ионов водорода в растворе. Естественно, что в условиях прототипа аналогично оттитруется и любая другая кислота.

Предлагаемый способ является прямым, т,к. регистрируется поглощение именно анализируемого белка, связанного в комплекс с ионами меди. Это также обеспечивает значительно большую селективность и точность определения.

Если в способе-прототипе возможна перетитровка (т.е. использование избыточного количества реактива-титранта), приводящая к порче пробы, то в предлагаемом способе избыток реактива, не связанного с белком, выпадает в осадок и отделяется центрифугированием. Этим он, кстати, отличается от различных разновидностей биуретового реактива (5 — 71, где соли меди, стабилизированные цитратами или тартратами (например, сегнетовой солью), остаются в растворе и мешают спектрофотометрическому определению, Кроме того, биуретовый реактив дает одинаковую окраску со всеми белками, что не позволяет определять какой либо один, в данном случае анализируемый белок.

Удаление избытка меди из раствора предохраняет анализируемые пробы от порчи, что, в конечном итоге, способствует повышению точности способа, Наличие в составе аналитического реагента пероксида водорода прело ран яет образовавшийся комплекс белка е медью от восстановления последней до Сii, О. Эго пп1776351 зволяет проводить анализ в присутствии большого количества восстанавливающих сахаров, а также аскорбиновой кислоты,,содержащихся в медопродуктах или добавля емых в качестве консерванта и 5 антиокислителя к апилаку, Таким образом, использование системы CuSO<+H20z расширяет функциональные возможности способа, Точность предлагаемого способа в 3,6 10 раз выше, длительность — в 5,4 раза ниже, чем у прототипа. Помимо этого, способ имеет более низкуютрудоемкость, поэволяетанализировать большее разнообразие продуктов, содержащих пчелиное маточное молочко, т,е. 15 обладает большими функциональными возможностями.

Пример 1. Определение количества анализируемого белка в маточном молочке, Сравнение способа-прототипа и предлагае- 20 мого способа, 0,1 — 0,3 r маточного молочка растворяют при перемешивании в 2 мл 1 н, раствора NaOH. К полученной смеси добавляют 50 мкл 30 -ного Н202. затем через 30 с порциями по 50 мкл приливают 1ф,-ный 25 раствор CuSO< до появления опалесценции.

Полученную систему центрифугируют 2-3 мин, а затем спектрофотометрируют на длинах волн 556 (As) и 680 (Ав) нм. Содержание белка находят по формуле: 30

Х = (1,22 А5-А6), g где Х вЂ” количество анализируемого бел- 35 ка, мг/r:

W — общий объем анализируемого раствора, мл;

g — масса навески маточного молочка, г;, А5, Аб — оптические плотности раство- 40 ров на длинах волн 556 и 680 нм.

Проведенные анализы показали, что содержание белка в нативном маточном молочке колеблется от !57 до 345 мг/г(обычно

240-310 мг/r), в лиофилизированном апила- 45 ке 986 мг/г (обычно 685 — 885 мг/г).

В табл, 1 приведены результаты сравнительных испытаний прототипа и предлагаемого способа. Поскольку результаты анализа не соизмеряемы по абсолютной ве- 50 личине, анализируются различные вещества, для сравнения точности анализируемых методик используются коэффициент вариации и ошибка среднего арифметического..

Результаты испытаний показали, что 55 точность предлагаемого способа в 3,6 раз выше, чем прототипа.

Пример 2. Определение количества ,магочного молочка в медопродуктах и других продуктах лечебно-профилактического

Амеде

b =—

А еда которую, затем, подставляют в формулу (2):

Х 5,791 а Ь.l@" — Аб г

g Ь вЂ” 0,48.1 где XMn — подержание белка маточного молочка в медопродукте.

Зная количество белка в чистом маточном молочке (Хмм) и количество этого белка в медопродукте, находят содержание маточного молочка

Содержание маточного

Хмп . 1OOo/

Хмм молочка в медопродукте

Если нет возможности проанализировать чистые мед и маточное молочко, содержание белка в медоггродукте определяют по формуле (1). Оно должно составлять 3,14-6,90 мгlг, Так, проведенный анализ "Апибальзама — 1", содержащего 2 маточного молочка, показал наличие белка в количестве

6,33 +0,32 мг/г (коэфф. вариации =3,83 ).

Пример 3. Изучение комплексообразования белков маточного молочка с солями меди. Маточное молочко содержит высокомолекулярный гидрофильный белок. образующий благодаря высокой концентрации серина и треонина комплексные соединения с солями меди Си2+, специфически поглощающими в фиолетовой области — 556 нм. Другие белки маточного молочка, а также белки. и полисахариды меда образуют комплексы, поглощающие при 630-680 нм.

Фиолетовый комплекс (далее V-комплекс) является болев прочным, чем комплексные питания. Для точного определения содержания маточного молочка в медопродуктах необходимо предварительно провести анализ маточного молочка и меда. 0,4-0,8 r медопродукта. например "Апибальзама — 1" и такое же количество чистого меда растворяют в 2 мл 1 н. NaOH, к растворам прибавляют 100 — 300 мкл 30 -ного HzOz и через

30-60 с 300 — 400 мкл 1 -ного CuS04. через

5-10 мин после добавления соли меди проводят измерения Ag и Ав, Анализ маточного молочка осуществляют, как в примере 1.

Для расчета процентного содержания маточного молочка находят величину "b":

1776351

10 соединения других белков с ионами меди, 3,3. Зависимость выхода V-комплекса ог поглощающими в синей (б80 нм) области концентрации меди в растворе. (далее В-комплексы). По мере добавления К раствору 0,01б г маточного молочка в

2+ раствора Си сначала образуются красно- 2 мл 1 í. NaOH приливали 0,05 мл 30 -ного фиолетовые растворы V-комплекса, затем 5 H20$ и затем добавляли 1 -ный pBGTRop появляются сине-фиолетовая окраска, ха- CuS04 порциями по 0,05 мл. Через 5 мин рактерная для смеси V- и В-комплексов. На- после прибавления каждой порции проиэличие специфической области поглощения водили измерения оптической плотности на длине волны 556 нм позволяет использо- при 556 и 680 нм. Количество V-комплекса вать V-комплекс меди для аналитических це- 10 находили, как в примере 1. В качестве станлей, дарта для расчета содержания В-комплекса

3,1 Зависимость поглощения Ч-комп- использовали комплекс Си с аргинином.

2+ лекса от количества маточного молочка. Из табл. 4 следует, что по мере добавлеНавески маточного молочка растворяли ния раствора меди концентрация V-компв 3 мл 1 н. МаОН., добавляли 1,0 мл 1 -ного 15 лекса сначала возрастает, затем становится

CuSOq. Осадок отделяли центрифугирова- постоянной — 280,15 ч-1,11 мг/г. После донием, надосадочную жидкость фотометриро- бавления избыточных обьемов раствора навали при 556 нм. В качестве контрольного чинается выпадение осадка Cu(OH): раствора использовали комплекс аминокис- количество анализируемого комплекса при логы аргинина, полученный в аналогичных 20 этом уменьшается, что, вероятно, вызвано условиях. появлением окрашенных гидроксосоединеОпределение типа зависимости погло- ний меди, приводящих к изменению козфщения V-комплекса от. количества маточно- фициента "Ь" в формуле (2). Таким образом, го молочка приведено в табл. 2. наилучший выход комплекса достигается

Данные, приведенные втабл.2, показы- 25 при добавлении максимальных количеств вают, что.зависимость является строго ли- раствора меди, не вызывающих образованейной — коэффициент корреляции г=0,989. ния осадка Cu(OH)z. Следовательно, в проЭто позволяет использовать V-комплекс для цессе анализа добавление CuSO< следует определения содержания молочка в смесях проводить до появления опалесценции расс другими веществами, 30 твора.

3.2. Зависимость выхода и скорости об- Заивисимость выхода V-комплекса от ., раэования Ч-комплекса от концентрации концентрации меди в растворе приведена в растворов щелочи и ве»;чины рН. табл. 4, Использование серии буферных раство- Пример 4. Стабилизация комплексов ров ь <ачеств =- растворителей для маточного 35 балка и Си пероксидом водорода, 2+ молочка показало, что комплексы меди с Соли двухвалентной меди проявляют в белком образуются, если рН смеси не мень- сильно щелочной среде окислительные ше 1 1, Оптимальный интервал 12,25 — 13,55 свойства и легко реагируют с восстановитеединиц рН. лями, содержащимися в маточном молочке, Для определения оптимальной концен- 40 меде, витаминизированных медопродуктах. трации щело«и одинаковые навески маточ- Наиболее сильными восстановителями явного молочка (0,02 г) растворяли в 2 мл 0,05; ляются аскорбиновая кислота и альдегидо0,5; 1.,0; 2.0: "..:.0; 4,0: 5,0; 10,0 н. растворах сахара, разлагающие Н-комплекс с

ИаОН. Оптическую плотность растворов по- образованием СщО. Нестабилизированный сле добавления 0,2 мл 1 CuSO< измеояли 45 комплекс разлагается при анализе маточнопри 556 и 680 нм каждые 30 .. го молочка за 15 — 30, при анализе медопроПроведзкные измерения (табл. 3) пока- дуктов — за 2 — 7 мин.

=-али, что наибольший вы; д V комплекса В качестве стабилизаторов были ис у (А p;:„.) наблюдается в 1,0- 5.0 н. растворах пользованы сильные окислители — персульМаОН. Соотношени поглощения надлинах 50 фат аммония в концентрации 10 г/л волн 556 и б80 нм в этом интервале концен- . (насыщенный раствор) и 30 -ный пероксид траций сохраняется постоянным, время водорода. Исследования показали, что максимального выхода комплекса изменя- (NH4)zS20e действует очень медленно и поется от 0,5 до 6,0 мин, что приемлемо при этому не пригоден для анализа. проведении анализа. В 0,5 н.растворе ана- 55 4,1, Зависимость устойчивости V-комплиэируемый г .родукт вообще не образуется, лекса в маточном молочке от количества дот.к. его рН i0,21 (<12,25). бавленного 30%-ного Н202.

Зависимость выхода V-комплекса от 0,103 г маточного молочка растворяли в кпнцептрации растворов щелочи приведена 2 мл 1 í, NaOH, добавляли 25-100 мкл 30%в табл. 3>. ного Н202 и 300 мкл 1%-нога Сц O„. Обьем

1776351 раствора доводили 1 н. NaOI- до 2,5 мл.

Оптическую плотность измеряли на длине волны 556 нм.

Зависимость устойчивости V-комплекса в маточном молочке от количества Hz02 приведена в табл, 5.

Добавление к раствору маточного молочка 30%-ного HzOz в количестве более 25 мкл практически полностью стабилизирует

V-комплекс, образующийся при последующем добавлении CuSO4. Такое же количество пероксида водорода достаточно для стабилизации лекарственных средств с апилаком — таблеток, мазей, свечей.

4.2, Зависимость устойчивости комплексов Си в меде и медопродуктах от навески последних и от объема 30%-ного пероксида водорода.

В случае анализа медопродуктов требуется значительно большее количество пероксида водорода, Это объясняется наличием в меде значительно большего количества альдегидосахаров и аскорбиновой кислоты, Из-за высокой скорости распада комплекса большое значение имеет количество меда, взятого на анализ. Измерения времени устойчивости комплекса при использовании разных навесок медопродукта и объемов Н202, проведенные в 20 точках (в трех параллелях), позволили вывести эмпирическое уравнение вида: °

g= — 0,74 — 0,96 + 0,189, t 1

1202 W 2o2 связывающее все варьируемые параметры, Так, если для стабилизации взято 300 мкл

HzOz и необходимо, чтобы комплекс был устойчив в течение 30-40 минут, согласно уравнению навескэ должна составлять

0,094 — 0,118 r.

Оптимальными для анализа меда и медопродуктов являются объемы в интервале от 200 до 400 мкл, При Wpgog <200 мкл время существования комплекса слишком мало для осуществления способа; при

Wagon 400 мкл в растворе образуются медленно разлагающиеся пероксосоединения меди, искажающие результаты анализа.

4.3. Последовательность и длительность процедур, необходимая для стабилизации комплекса, Для сохранения комплекса необходимо, чтобы при внесении раствора CuSO4 почти все восстанавливающие примеси были окислены. Поэтому при осуществлении способа сульфат меди добавляют в анализируемый раствор после пероксида водорода, Временной интервал между внесением

НрОр и САБО также оказывает влияние на устойчивость V-комплекса.

0,124 r меда растворяли в 2 мл 1 н.

NaOH, затем к раствору приливали 200 мкл

5 30%-ного I20z. Через определенный промежуток времени (1. ) добавляли 400 мкл

1%-ного CuSO4 и измеряли время между образованием комплекса и его распадом (t), Зависимость устойчивости комплекса

10 от интервала между внесением растворов

Н О2 и CuS04 приведена в табл.4, Полученные результаты, приведенные в табл. 7, показывают, что комплекс наиболее устойчив, если раствор CuSO< вносят в ана15 лизируемую смесь через 0,25 — 1,00 мин (1560 с) после добавления 30%-ного Н202.

Пример 5. Выведение формулы для расчета количества белка, реагирующего с солями Cu + с образованием V-комплекса.

20 Поскольку V-комплекс приходится определять на фоне различных концентраций

В-комплекса, наиболее удобным является использование уравнений Фирордта для двухкомпонентных смесей (8). Измерения

25 оптической плотности проводят надвухдлинэх волн 556 (As) и 680 (Ав) нм, Тогда;

А6 =Аб +А6 =е6 Сч + еб Сь

А5 =As +As =Ф Сн+% Сь (5)

30 где As, Ао",.Аоь — поглощение при 680 нм анализируемого раствора, V- и В- комплексов;

As, As", As — поглощение при 556 нм анализируемого раствора, V- и В-комплек35 сов; а", В", а", а"- молярные коэффициенты погашения комплексов при 680 и 556 нм;

Сь и С вЂ” концентрации комплексов, Пусть соотношение молярных коэффи40 циентов погашения при 680 и 556 нм равно: для V-комплекса: ч = —;

@ (6)

45 для Ь-комплекса: Ь = —, 4

Я

Решая систему уравнений (5) относительно Cv и подставляя величины v u b (6), получаем: с

55 g (b v)

Отсюда выводим расчетную формулу:

Х—

M И/ be — A6

9 pg (b — у) 14

1776351

20

30

45 где М - молекулярная масса белка-стандарта, г/моль;

* — остальн ые обозначения см. пример 1 (формула 1) и пример 6 (формулы 5 — 6).

Поскольку молекулярная масса и коэффициент малярного погашения анализируемого белка не известны, в качестве стандарта используют сывороточный человеческий альбумин. Комплекс альбумина с медью имеет максимум поглощения при 556 нм, величина "v" у него совпадает с белком для маточного молочка — 0,481.

При использовании этого стандарта формула приобретает вид:

Х 5791 л . Ь А6

g Ь вЂ” 0,481

Величина Ь, характеризующая В-комплекс, для маточного молочка равна в среднем, 1,220; для меда колеблется в пределах

1,220 — 1,316. Определение величины Ь описано в примере 2.

Пример 6. Сравнение продолжительностей осуществления способа-прототипа и . и редла га ем о го способа, Хронометраж прототипа и предлагаемого способа, выполняемых в трех параллелях. приведен в табл. 7..

Результаты хронометража аналитических операций показывают, что предлагаемый способ осуществляется в 5,4 раза быстрее, чем прототип, В отделе криобио:;имии и фармакологии нейрогуморальных систем института проблем криибиологии и криомедицины АН

УССР в ноябре 1990 года была проведена экспериментальная проверка предлагэемого способа (размещение на испытания и акт прилагаются), За базовый обьект взят прототип, а за новый — предлагаемый способ;

Результаты экспериментальной проверки свидетельствуют о том, что предлагаемый способ имеет следующие преимущества перед базовым обьектом: в качестве анализируемого компонента, имеющегося в апилаке и отгутствующего в меде и наполнителях лекарственных препаратов, используется специфический белок маточного молочка; количество белка определяют по ин1ен синности окраски его комплекса с ионами меди путем растворения апиллксодержащего продукта в 1,0 — 5.0 н. раствора NaOH, добавления 25-300 мкл 30%-ного HzOz u через 15 — 60 секунд 1 -ного CuSOq в o6beме, необходимом для образования оналесценции.

Предлагаемый способ имеет точность в

3.6 раза выше, длительность анализа.— в 5,4 раза ниже, чем прототип; является менее трудоемким, позволяет анализировать более широкий спектр продуктов, в том числе и с низким содержанием маточного молочка.

Формула изобретения

Способ определения концентрации пчелиного маточного молочка в фармацевтических препаратах и медопродуктах, предусматривающий извлечение из пробы анализируемого продукта компонента, характерного для пчелиного маточного молочка, установление значения концентрации этого компонента, коррелирующего со значением концентрации пчелиного маточного молочка в исходном анализируемом продукте, отличающийся тем, что, с целью повышения точности, сокращения времени и трудоемкости, в качестве компонента, характерногодля пчелиного маточного молочка, используют специфический белок маточного молочка, установление значения концентрации последнего осуществляют путем после-

35 довательного введения в пробу анализируемого продукта 1,0 — 5,0 N раствора

NaOH, 30 -ного пероксида водорода, выдержку полученной смеси в течение 15 — 60 с и введение 1 -ного раствора CuSO4 при обь40 емно-массовом соотношении пробы анализируемого продукта, раствора NaOH,ïåðîêcèäà водорода, раствора CuSO4 соответственно

20-60:2-3:0,025-0,30:0,25 — 0,75 (мг:мл;мл;мл). центрифугирование полученного комплекса, фотометрирование надосадочной жидкости на длинах волн 556 и 680 нм и установление значения оптической плотности, соответствующего значению концентрации специфического белка маточного молочка. в 0,05 í. NaOH комплекс не образуется, 15

1776351

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

1776351

Габлицл

*Добавление раствора CuS04 вызвало образование осадка.Фотометрию проводили после центрифугирования.

Таблица 5

Таблица

*Hg0; не добавляли.

1776351

Таблица 7

ПРЕ ЛАГАЕМЫЙ СПОСОБ

СПОСОБ-ПРОТОТИП

Время выполнения, мин

Название про

Название процедуры лне15

1 5*

Взятие нав

Перемешив

Добавление Н20

Центрифугиро

Спектрофотометр

Об ее в емя анализа 255мин

47 мин

* Данную операцию проводят одновременно или почти одновременно для всех трех параллелей, Редактор

Заказ 4051 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35,,Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород. ул.Гагарина, 101

Взятие навески

Перемешивание

Экстракция эфиром

Реэкстракция 1N раствором NaOH

Создание градиента рН

Экстракция эфиром

Промывка водой

Сушка Na2SO4

Упаривание

Тит ование

15*

Составитель В.Петраш

Техред М.Моргентал Корректор В,Петраш