Способ получения реагента для типирования антигенов эритроцитов

 

< сЫ 1780756 А1 (я)й A 61 К 39/395 союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)

ОПИСАНИЕ ИЗОБлРЕтТЕНИт !,:",::-,.::::::::::-:::-,:,::::::::,.;:,1

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1:;. :.-- —.: ::, . 2 (21) 4858031/14 . .. :, (57} Использование изобретения для попучения реа(22) 08.о8.90 .. .,: гентов, используемых фй типйрования антиге(46) 15.12.92. Бюл. М 46 .:,::: нов эритроцитов. Цель; повышение выхода (71) Ленинградский научно-исследователь- целевого йродлукта и упрочщейие способа.. ский институт гематологии и переливания Сущность изобретения: фруглумин А и В; крови и Ленинградский научно-исследова- выделенный из слизистой желудков животельский институт эпидемиологии и микро- : тных, иммобилизуют на цианбромактивиробиологйи им. Пастера . - ": ванной агарозе. После иммобилизации (72} К.Н.Климова; А.Б.Жербрун, А.А.Раки- ::: сорбент помешают, в колонку и проводят тянская, Н,В.Минеева, M.À.Ìàòâååâà и сорбцию антител из сыворотки со скороГ.Ф.Быстрова .:: :- ":, стьа50 мл/ч см2. Элюцию антител с колон(56) Blochim. Blophys; acti, 1974,263, МЗ, р. ки осуществляют цитратно-фосфатным .

567-574.. - буферным раствором при рН 2,0-2,5 и ско- (54} СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕАГЕНТА ДЛЯ рости 10 мл/ч см ..Положительный эффект:

ТИПИРОВАНИЯ АНТИГЕНОВ ЭРИТРОЦИ- способ позволяетувеличить выход целевого

ТОВ: .;:.::: -:: продукта и упростить способ.

Фч

°м ч ич ч,ы

Изобретение относится к медицийе и Описанный метод имеет ряд существенкасаетсяспособовполучения реагентов, ис- ных недостатков: 1, В качестве активных пользуемых для типирования внтигенов: центров сорбента используют А и В антигеэритроцитов; -: - -: ::., : ны человека, при взаимодействии с антите- QQ лами образуется. сильная ковалентная р

Реагенты для определения rpyriri крови связь, выход конечного продукта после сорвозможно готовить из фракций антител, вы- . бции низок (до 10 от исходной). 2, Элюделенных из цельных сывороток методом: . цию антител осуществляют только. при аффинной хроматографии. Очищенный ан-- . использованийхаотропных ионов(трифлуо- О тигены А и В, выделенные из кисты яичника роацетата), что оказывает отрицательное человека, иммобикливуют на Сефааоле 2В, аовдействие на очищенные антитела, сниактивированной бромцианом. Через колон- жая их стабильность. ф ку с антигеном пропускают сырье АВЩ спе- -... Цель изобретения; повышение выхода цифичности и сорбируют соответствующие целевого продукта и упрощение способа его антитела. Элюцию антител осуществляют . получения. трифлуороацетатом вфосфатном буферном Укаэанная цель достигается путем аф растворе (рН 7,2-7,4). Полученные фракции финной хроматографии АВО сырья на агароантител стабилизируют путем диализа в те- зе, активированной бромцианом, чение 18 часов против ФБР (рН 7.2) с добав- коньюгированной с антигенами А и В-подолением хлорида натрия.. бными животного происхождения при сорб-.

1780756

Составитель М.Матвеева

Техред M,Mîðãåíòàë Корректор Л.Ливринц

Редактор

Заказ 4229 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета.по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

3 ции антител со скоростью 50 мл/ч х см и элюции их цитратно-фосфатным буферным раствором(рН 2,0-2,5) со скоростью 10 мл/ч хсм.

Предлагаемый способ фракционирова- 5 . ния осуществляется следующим образом: выделяют фруглумин А и В путем ферментативного переваривания слизистых желудков свиньи и лошади. Иммобилизуют антигены на цианбромактивированной ага- 10 розе, для чего агарозу суспендируют в"рас- творе CNBr и смесь уравновешивают в течение 10 мин, в процессе активации рН поддерживают на уровне 11,0 добавлением

ЗМ гидроокиси натрия, Активированный 15 гель немедленно "отмывают дистиллированной водой, затем 0,5 М раствором МаНСОз при рН 8,5. А и В вещество в концентрации

1 мг/мл добавляют и выдерживают на ро-. .: торной мешалке в течение 18 ч . Аминокар- 20 бонатные группы блокируют 0,5 М раствором глицина на ФБР. Для оцейки эффективности связывания антигенов с йоси-. телем контролируют концентрацию белка в .. исхОдном растворе антигена и во всех про- 25 бах промывной жидкости, полученных в процессе иммобилизации. После йммобилизации сорбент помещают в колонку. Объ- .. ем колонки составляет 8 ммз, объем " сорбента — 1 мм . Иммуносорбент использу- 30 з ют многократно (10-20 раз) без потери спе- цифической активности для сорбции соответствующих антител из сырья, объем" которого в 10 раз превышает объем сорбен-. та. Оптимально проводить сорбцию антител 35 из сыворотки со скоростью 40-60 мл/ч х смг, Элюцию антител с колонки осуществля ют цитратно-фосфатным буферным раствором при рН 2,0-2,5 и скорости 7-12 мл/ч х

Примеры конкретного осуществления способа:.

П ример 1, В матерйалахзаявки, где " скорость сорбции -50 мл/часхсм, скорость г злюции — 10 мл/ч хсм . - 45

Пример 2. Получали фракцию анти — В айтител из гипериммунйой сыворотки крови барана, иммуййзированного эритроцитами

: человека группы крови В..Титр антител в 50 исходном сырье составлял: анти- — 1:

1024, гетероантител — 1: 256. Объем сыворотки — 10 мл, объем сорбента — 1 мм .

Колонку с сорбентом промывали 10 объемами Ф БР (рН 7,2), затем пропускали сыворотку со скоростью 40 мл/ч х см Элюцию сорбированных антител проводили ЦФБ (рН 2,5) со скоростью 7 мл/час х смг Объем фракций сорбировнных антител составлял 2 мл, Фракции нейтрализовали 0,5 н раствором гидроокиси натрия. Титр специфических антител составлял 1.: 1024-1: 2048, Гетероантитела в полученных фракциях отсутствовали.

Пример 3:, Получали фракцию анти-А антител из гипериммунной сыворотки крови кролика, иммунизированного эритроцитами человека группы А. Титр антител в исходном сырье-составлял: анти - А 1: 2048, гетероантител — 1: 1024. Обем сыворотки был равен 10 мл, объем сорбента — 1 мм ..:

Колонку с сорбентом промывали 10 объемами Ф БР (рН 7,2); затем пропускали сыворотку со скоростью 60 мл/ч х смг, Элюцию.: сорбированйых антител йроводили ЦФБ . (рН 2,5) со скоростью 12 мл/ч х см . Объем фракций элюировайных антител составлял 2. мл. Пробы нейтрализовали 0,5 н раствороМгидроокиси натрия. Титр специфичных анти-А антител во фракциях составлял 1:

1024. Гетероантитела в полученных фракци-. ях отсутствовали.

Фо рмула изобретения

Способ получения реагента для типирования антигенов эритроцитов путем аффинной хроматографии,:. сырья АВО специфичности на агарозе, активированной бромцианом и конъюгированной с антигенами А и В специфичности, сорбции антител из сыворотки с последующей их элюцией с сорбента буферным раствором, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью павышения выхода целевого продукта и упрощения способа, в качестве антигенов А и В специфичности используют фруглумин А и В, выделенный из слизистой оболочки желудка . животных. сорбцию антител проводят со скоростью 50 мл/ч х см, а элюцию осуще-: ствляют цитратно-фосфатным буферным раствором при рН 2;0 — 2,5 со скоростью 10 мл/ч х смг.