Способ получения трансгенных растений картофеля

 

Использование: в сельском хозяйстве для создания растений с заданными свойст вами. Сущность изобретения: введение чужеродной генетической информации в меристематические клетки пазушных почек и получение трансформированных побегов, минуя стадии каллусои морфогенеза. Способ обеспечивает возможность трансформации растений, которые не могут быть регенерированы из протопластов или тканей листьев, стеблей, клубней, сникает время получения трансгенных растений и дает возможность сохранить первоначальную генетическую целостность трансформированных растений

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧ Е СК ИХ

РЕСПУБЛИК (я)л А 01 Н 1/00

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) 4

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4908115/13 (22) 29.12.90 (46) 23.12.92. Бюл. N. 47 (71) Институт общей генетики им, Н.И.Вавилова и Институт физиологии растений им, К.А.Тимирязева (72) С.А.Дмитриева, B,È,Негрук и А.И.Гладкий (56) Новые направления биотехнологии.

Всесоюзная конференция, Пушино, 1988, 3—

5 октября. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ

РАСТЕНИЙ КАРТОФЕЛЯ (57) Использование: в сельском хозяйстве

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии и может быть использовано для получения растений с заданными свойствами.

В настоящее время разработаны методы трансформлции протопластов, листовых дисков, тканей стеблевых л корневых сегментов, а также дисков клубней картофеля.

Однако некоторые важные виды сельскохозяйственных культур не могут быть регенерированы из протопластов или ткани листьев, стеблей, клубней, Обычно трансформированные растения получают через

2-3 мес. При этом вследствие длительной селекции трансформир9ванного каллуса высока потенциальная возможность сомаклональной вас иабельности в растениях. регенерированных иэ этого каллуса, Это явление неже dãåëüíî в тех случаях. когда необходимо ссхранить первоначальную генетическую целостность трлнсгенных растений.

„„5U„„1782484 А1 для создания растений с заданными свойствами. Сущность изобретения: введение чужеродной генетической информации в меристематические клетки пазушных почек и получение трансформированных побегов, минуя. стадии каллусо- и морфогенеэа. Способ обеспечивает возможность трансформации растений, которые не могут быть регенерираваны из протопластов или тканей листьев, стеблей, клубней. сни.кает время получения трансгенных растений и дает возможность сохранить первона альную генетическую целостность трансформированных растений.

Целью изобретения является создание способа трансформации картофеля, обеспечивающего сокращение срока получения трансгенных растений и сохранение их первоначальной генетической целостности. р

Поставленная цель достигается тем, что применили способ трансформации к«ртофеля. заключающийся в отборе стерил,ных + зксплантов, помещении их в агариэованную О© среду, инокуляции жидкой культурой «гробактерии, отмывании эксплантов от агробактерии, культивировании на соответс1вующей среде, черенковании выросших побегов и их укоренении. проверке встраивания чужеродной ДНК в ДНК полученных растений и проверке экспрессии трансформационного маркера — неомицинфосфотрансферазы-П. В качестве эксплантов использовали сегменты стеблей с одн вй н» пошедшей в рост пазушной почкой. В )бласти пазушной почки делали насечку. инокуляцию проводили в течение 12 36

1782484

Составитель С.Дмитриева

Редактор Т.MEльникова Техред M.Moðãåíòýë Корректор Д.Ливринц

Заказ 4465 Тйраж Подписное

ВНИИПО Государственного комитета по изобретениям и открьпиям при ГКНТ СССF

113335. Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". г. ужгород, ул.Гагарина. 101

3 культивирование проводили на агаризованной среде, содержащей канамицин (25-50 мкг/мл) и цефотакисм (250-500 мкг/мл), выросшие побеги высаживали в среду, содержащую 25-50 мкг/мл канамицина и не содержащую антибиотиков, подавляющих рост агробактерии, проводили выбраковку растений, проводящая система и/или система межклетников которых заражена агробактерией.

Пример. Брали сегмент стебля картофеля с одной пазушной почкой, не пошедшей в рост, в области пазушной почки делали насечку и на насечку наносили жидкую культуру агробактерии. После инокуляции 150 пазушных почек картофеля

Agrnbacterlurn tumefaciens, несущей "разоруженную" плазмиду pGA 472, в течение 32 ч черенки отмывали от агробактерии и высаживали в агаризованную среду, содержащую 50 мкг/мп канамицина и 500 мкгlмл цефотаксима. Через 2 нед было получено

102 побега картофеля.. Все выросшие растения были расчеренкованы и высажены в агаризованную среду, содержащую 50 мкг/мл канамицина и не содержащую антибиотиков для подавления роста агробактерии. При эт"м 38 пробирок {вариантов) заросли агробактерией. Эти растения были отбракованы. Из оставшихся 64 растений 3 укоренились. Из укоренившихся растений была выделена и проанализирована методом блот-гибридизации по Саузерну суммарная ДНК, Во всех препаратах ДНК. выделенной из трансформированных растений, имелись ь тавки чужеродной ДНК, Трансгенная природа полученных растений была также доказана наличием экспрессии трансформационного маркера-неомицинфосфотрансферазы-П, Весь опыт занял 4 нед.

5 В результате предлагаемого способа трансформации с использованием пазушных почек снижается время получения трансгенных растений картофеля и сохраняется первоначальная генетическая целост10 ность трансформированных растений. появляется возможность трансформации важных сельскохозяйственных культур, которые не могут быть регенерированы из протопластов или тканей листьев, стеблей, 15 клубней.

Формула изобретения

Способ получения трансгенных растений картофеля, предусматривающий помещение . экс,планта растения на

20 агаризованную среду, нанесение на экс, плант жидкой культуры агробактерий, проведение инокуляции, отмывание, культивирование на селективной среде с канамицином и цефотаксимом и проведение

25 отбора трансгенных растений, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью ускорения спо- . соба и сохранения генетической целостности трансгенных растений, в качестве экспланта используют черенок с одной. не

30 пошедшей в рост пазушной почкой, агро-, бактерии наносят на надрез в пазушной почке, инокуляцию проводят в течение 12Зб ч, полученные после культивирования побеги укореняют на среде без антибиотиков, 1

35 подавляющих рост агробактерий, и отбирают незараженные агробактериями рэстения,