Способ получения носителя для иммобилизации аминосодержащих соединений
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ! I ф 00 . О Ql Сд ) (21) 4794386/05 (22) 22.02.90 (46) 23.01,93, Бюл. N 3 (71) Отдел биохимии и цитохимии Башкирского научного центра Уральского отделения АН СССР (72) M.È.Ãàðèïoâà, И.А.Басченко, И.А.Еркеева и А.И.Шигапова (56) 1 . Goldstein et а!. "improvement polymeric composition".Biochemistry, 1970, V 99, N11,,р. 2322-2333. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НОСИТЕЛЯ ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ АМИНОСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ (57) Использование; получение высокоемкого носителя для иммобилизации аминосоИзобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения высокоемких сорбентов, обладающих значительной механической прочностью и устойчивостью к химическим воздействиям. (Наиболее часто применяемыми носителями для иммобилизации биологически активных соединений до настоящего времени являются полисахаридные матрицы. Одним из методов, позволяющих получить сорбент с высокой специфической емкостью, является метод, включающий в себя сшивку диальдегидкрахмала-продукта периодатного окисления крахмала, метилендианилином, восстановление образовавшихся оснований Шиффа боргидридом натрия, диазотирование остаточных аминоарильных групп и последующее связывание белков. Емкость по связыванию для этого носителя составляет 80 — 100 мг/г, специфическую активность „„ „„1789532 А1 держащих соединений, обладающего повышенной эффективностью и работоспособностью. Сущность изобретения, способ осуществляется окислением раствора поливинилового спирта перйодатом натрия из расчета 5 — 7 мг перйодата на 1 мл 10%-ного водного раствора поливинилового спирта. Гель формируют путем выдержки окисленного продукта при рН 1, температуре 37 С, в течение 48 ч с последующим измельчением и дополнительной обработкой при аналогичных условиях (рН 1, Т=37 С, 48 ч) 5 g,-ным раствором глутарового альдегида. При этом соотношение между гомогенизированным гелем и раствором глутарового альдегида составляет 1:1 по объему. сохраняет 25 — 557; связанного белка. Обычно носител ь диал ьде гид крахмал-метил е ндианилин используется для получения иммобилизованных ферментов, Недостатками указанного способа иммобилизации являются: многостадийность и использование высокотоксических веществ; плохие колоночные свойства носителя, препятствующие широкому распространению этого метода иммобилизации лигандов; нестабильность носителя при крайних значениях рН и неустойчивость к действию ферментов микроорганизмов, Цель изобретения — увеличение работоспособности и повышение эффективности. Предлагаемый способ заключается в получении альдегида поливинилового спирта /ПВС-полиальдегида/ путем окисления 10% раствора поливинилового спирта /ПВС/ с молекулярным весом 30 тыс, Д периодатом натрия из расчет 5-7 мг периодата 1789532 на 1 мл 10 -ного раствора ПВС в течение 30 мин при комнатной температуре с последующей сшивкой полученного продукта за счет протекания реакции ацетилирования остаточных гидроксильных групп ПВС, составляющих около 95/ от их исходного количества, образовавшимися альдегидными группами при рН 1, 37 С в течение 48 ч, в течение которых формируется гель необходимой пористости. Полученный блок затем размельчается и подвергается дополнительному упрочнению и активации. Зто достигается обработкой гомогенизированного измельченного геля 5 Д -м раствором глутарового альдегида при рН 1, 37 С, при объемном соотношении гомогенизированного геля и 5/-ного раствора альдегида 1;1, При этом глутаровый альдегид ацетилирует оставшиеся гидроксильные группы. Для иммобилизации же аминосодержащих соединений используются как альдегидные группы ПВС-альдегида. не -вступившие в реакцию при формировании геля, так и альдегидные группы, введенные за счет ацетилирования носителя глутаровым альдегидом, Полученный этим способом носитель обладает хорошими колоночными свойствами, не разрушается при действии крайних значений рН, органических растворителей, детергентов, ферментов микроорганизмов, выдерживает кипение. В ходе изготовления носителя происходит его стерилизация. Высокая плотность альдегидных групп /80 мкмоль/мл/, наряду с развитой поверхностью, обеспечивает возможность изготовления на основе предлагаемого носителя сорбентов с высокой емкостью, Пример (прототип). К 200 мл 5 Д -ного крахмала, окисленного периодатом натрия из расчета 7 мг периодата на 1 мл раствора при комнатной температуре в течение 30 мин, добавляют 40 мл карбонатного буфера рН 10,5, 2М. Полученный раствор медленно вливают в энергично размешиваемый 10/ раствор метилендианилина в метаноле /400 мл/. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 3 дня. Нерастворимые частицы сшитого полимера промывают на воронке Бюхнера метанолом, суспендируют в воде и восстанавливают боргидридом натрия из расчета 40 г на полученное количество носителя в течение 18 часов при комнатной температуре, Реакционную смесь нейтрализуют уксусной кислотой, гель промывают водой и метанолом /по 300 мл/ и высушивают на воздухе. 100 мг высушенного носителя суспендируют в 8 мл 50 -ной уксусной кислоты и перемешивают 1 ч, Водный раствор нитрита натрия /20 мг/мл/ добавляют по каплям к 55 полученной суспензии при охлаждении, смесьперемешивают1часпри0 Си затем доводят рН до 8,5 5Н едким натром. Нерастворимый полимер промывают 0,2 М фосфатным буфером рН 7,8 на воронке Бюхнера и суспендируют в 6 мл того же буфера, затем постепенно добавляют 10 мл того же буфера, содержащего 15 мг протеина А золотистого стафилококка, Смесь перемешивают в течение ночи при 4 С и промывают на воронке Бюхнера 200 мл 1М хлорида калия, 100 мл дистиллированной воды и суспендируют в забуференном 0,01 М фосфатным буфером рН 7,2 физиологическом растворе (ЗФР). Затем проводят аффинное выделение человеческого иммуноглобулина из сыворотки в колонке. С 1 мл носителя элюировано в среднем 8,5 мг иммуноглобулинов. Максимальная скорость тока колонки падает в 2 раза в течение часа, Пример 2, 100 мл 10/-ного раствора ПВС окисляют периодатом натрия, добавляя при постоянном помешивании 700 мг периодата натрия и выдерживают при комнатной температуре 30 мин. Окисление проходит в течение первых минут процесса, при этом вязкость достигается 4,41 — 4,28 м /с и 2 в дальнейшем с увеличением времени окисления практически не меняется. Затем рН доводят соляной кислотой до 1 и выдерживают 48 ч при 37 С. Полученный блок разбивают при помощи ножевого гомогенизатора, промывают на воронке Бюхнера 400 мл дистиллированной воды и суспендируют 200 мл 5 глутарового альдегида, доводят рН концентрированной соляной кислотой до 1 и выдерживают 48 ч при 37 С. При этом объемное соотношение гомогенизированного геля и 5 /-ного раствора глутарового альдегида составляет 1:1, Если расчитывать это объемное соотношение на гель в форме блока, то оно равно 1:2, При гомогенизации объем геля увеличивается в 2 раза и это приводит к изменению соотношения, причем объем гомогенизированного геля может незначительно варьироваться. 3 мл полученного носителя отмывают дистиллированной водой до отрицательной реакции на альдегиды по Шиффу, а затем карбонатным буфером рН 8,5 0,1М, К 3 мл отмытого носителя добавляют 3 мл того же буфера, содержащего 15 мг протеина А золотистого стафилококка, выдерживают в течение ночи при 4 С, закрывают непрореагировавшие альдегидные группы 0,1М моноэтаноламином при рН 8,0 в течение 4 ч при 22 С, восстанавливают основания Шиффа боргидридом натрия /1 мг/мл/ в течение 4 ч при комнатной температуре, отмывают ЗФР и загружают в колонку для 1789532 45 проведения аффинного выделения иммуноглобулинов человека. С 1 мл носителя элюировано в среднем 9 мг иммуноглобулинов. Максимальная скорость тока колонки с диаметром 20 мм и объемом носителя 3 мл оставалась неизменной в течение 5 циклов аффинного выделения /10 ч/. Пример 3. 100 мл 10 ного раствора RBC окисляют периодатом натрия, добавляя при постоянном перемешивании 500 мг периодата, выдерживают при комнатной температуре 30 мин. При этом достигается вязкость 5,25-5,18 м /с, после чего доводят 2 рН концентрированной соляной кислотой до рН1 и выдерживают при 37 С 48 ч. Полученный блок разбавляют ножевым гомогенизатором, промывают на воронке Бюхнера 400 мл дистиллированной воды и суспендируют в 200 мл 5% глутарового альдегида, доводят рН концентрированной соляной кислотой до 1 и выдерживают 48 ч при 37 С. Полученный носитель отмывают дистиллированной водой до отрицательной реакции на альдегиды по Шиффу, карбонатным буфером рН 8,5, 0,1 М, К 3 мл отмытого носителя добавляют 3 мл того же буфера, содержащего 15 мг протеина А золотистого стафилококка, выдерживают в течение ночи при 4 С, закрывают непрореагировавшие альдегидные группы 0,1 М моноэтаноламином при рН 8,0 в течение 4 ч при комнатной температуре, восстанавливают основания Шиффа боргидридом натрия в концентрации 1 мг на миллилитр при комнатной температуре втечение 4 ч, отмывают ЭФР и загружают в колонку для проведения аффинного выделения иммуноглобулинов из сыворотки человека. С 1 мл носителя элюировано в среднем 8,5 мг иммуноглобулина, что достоверно не отличается от количества иммуноглобулинов, полученного в примере 2. Изменения максимальной скорости тока колонки в течение 5 циклов аффинного выделения (10 ч) не наблюдались. Пример 4 /контрольный/. К 100 мл 10 -ного раствора ПВС добавляют при пеФормула изобретения Способ получения носителя для иммобилизации аминосодержащих соединений. включающий окисление перйодатом карбоцепного гидроксилсодержащего полимера и формирование геля на основе продукта окисления, отличающийся тем, что, с целью повышения эффективности и увеличения работоспособности носителя, в качеремешивании 700 мг периодата натрия и выдерживают при комнатной температуре 30 минут. Затем рН доводят концентрированной соляной кислотой до 1 и выдерживают 20 ч при 37 С, Дальнейшие стадии проводят как в примере 2, С 1 мл полученного сорбента элюировано в среднем 1,5 мг иммуноглобулинов. Снижение емкости произошло, очевидно, из-за уменьшения активной поверхности носителя в результате формирования геля с более мелкими порами, Ухудшение колоночных свойств не зафиксировано, Пример 5 (контрольный). Формирование геля проводят по примеру 2. К измельченному и промытому гелю добавляют 200 мл 5 /, -ного раствора глутарового альдегида, доводят рН до 1 концентрированной соля ной кислотой и выдерживают 24 ч при 37 С. Последующие операции проводят аналогично тому, как это делалось в примере 2. Среднее значение емкости полученного сорбента составило 5 мг иммуноглобулина с 1 мл сорбента. Таким образом из приведенных примеров следует, что оптимальным условием получения носителя по предлагаемому способу является формирование геля на основе окисленного периодатом натрия 10 -ного раствора поливинилового спирта путем его выдержки при рН 1, 37 С в течение 48 ч с последующей гомогенизацией геля измельчением и обработкой при аналогичных условиях 5%-ным раствором глутарового альдегида при равном объемном соотношении, В результате такой обработки происходит повышение эффективности (улучшение колоночных свойств) и повышение работоспособности носителя, что, очевидно, обуславливается формированием геля необходимой пористости и емкости для сорбции соответствующих аминосодержащих соединений, а также его упрочнение за счет дополнительной сшивки глутаровым альдегидом. стве гидроксилсодержащего полимера используют 10 -ный раствор поливинилового спирта, окисление перйодатом натрия производят из расчета 5 — 7 мг перйодата на 1 мл водного раствора поливинилового спирта, последующее формирование геля осуществляют путем выдержки окисленного полимера при рН=1, температуре 37 в течение 48 ч до получения геля в форме блока с последующей гомогенизацией геля измель1789532 15 25 Составитель Г.Овчинникова Техред М,Моргентал Корректор Л,Пилипенко Редактор С.Кулакова Заказ 327 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 чением и обработкой при рН=1. температуре 37 С в течение 48 ч 5%-ным раствором глутарового альдегида при объемном соотношении гомогенизированного геля и 5;(,ного раствора глутарового альдегида, равном 1:1.
