Способ амплификации фрагмента днк неизвестной последовательности, расположенного на некотором расстоянии от фрагмента днк известной последовательности

 

Использование: молекулярная генетика , а именно способы размножения фрагментов ДНК неизвестной последовательности из определенной области ДНК. Сущность изобретения: осуществляют последовательные обработки ДНК рестриктазами и легирование, в результате которых фрагмент ДНК неизвестной последовательности, расположенный в нативной ДНК на некотором расстояний от фрагмента ДНК известной последовательности, оказывается непосредственно примыкающим к фрагменту ДНК известной последовательности; синтез олигонуклеотидных праймеров, проведение с их использованием амплификации (размножения) фрагмента ДНК неизвестной последовательности, 3 ил. SЈ

р . у р диа ностики (72) .В. Евграфов и А.В. Поляков (56) . Triglia et ai; NAR, v. 16, N 16. 1988.

Ж 04, Биология, 1989. (54

: МЕ

ВА

"НЕ

TEfl

СПОСОБ AMflЛИФИКАЦИИ ФРАГТА ДНК НЕИЗВЕСТНбй ПОСЛЕДОЛbl-!ÎÑÒÈ, РАСПОЛОЖЕННОГО НА

ОТОРОМ РАССТОЯНИИ ОТ ФРАГТА ДНК ИЗВЕСТНОЙ ПОСЛЕДОВАНОСТИ

Сущность изобретения. осуществляют по следовательные обработки ДНК рестриктазами и легирование, в результате которых фрагмент ДНК неизвестной последователь-" ности, расположенный в нативной ДНК на некотором расстоянии от фрагмента ДНК известной последовательности, оказывается непосредственно примыкающим к фрагменту ДНК известной последовательности; синтез олигонуклеотидных праймеров, проведение с их использованием амплификации (размножения) фрагмента ДНК неизвестной последовательности, 3 ил. ген ния .ват

Раз важ дал лен ван кач бре тах стр кло нос мар тол мен сти, — I зобретение относится к молекулярной тике, а именно к способам размножефрагментов ДНК неизвестной последоьности из определенной области ДНК. ножение фрагмента ДНК является ейшим необходимым этапом для его нейшего изучения; в частности, опредея его последовательности, и использоя в других исследованиях, например, в стве зонда ДНК. Преимущественно изоейие может быть использовано в рабоо поиску неизвестных генов в рамках тегии "обратной генетики", а также для ирования неизвестных последовательей ДНК, поиска новых полиморфных еров ДН К. В настоящее время известен ко один способ амплификации фрага ДНК неизвестной последовательнорасположенного на некотором расстоянии от фрагмента ДНК известной последовательности — способ инвертированной цепной полимеразной реакции.

Данный способ(фиг. 1) включает синтез олигонуклеотидных праймеров, получение линейных фрагментов ДНК, в которых фрагмент ДНК неизвестной последовательности флакирован фрагментами ДНК с известной последовательностью путем выделения ДНК из исследуемого объекта, обработки ДНК мелкощепящей рестриктазой, сайт рестрикции которой R1 присутствует во фрагменте ДНК известной последовательности, легир0вания- полученной смеси, обработкой ДНК крупнощепящей рестриктазой, сайт рестрикции которой R2 находится в известной последовательности на большем удалении от фрагмента ДНК йеизвестйой последовательности, чем сайт

1 7929 l2 рестрикции R1: или, вместо этой операции, нагреванием раствора ДНК для производства статистических разрывов в кольцевых

ДНК; с последующим проведением реакции полимеризации с использованием фрагмента ДНК неизвестной последовательности и п раймеров.

Недостатком способа является то, что может быть размножей только фрагмент, непосредственно примыкающий к фрагмен.ту ДНК известной последовательности. Указанный недостаток делает практически неэффективным применение этого способа для поиска неизвестных генов в рамках„ стратегии "обратной генетики", для чего в типичном случае необходимо проанализировать несколько десятков фрагментов, расположенных примерно равномерно на участке общим размером несколько десятков — несколько сотен тысяч нуклеотидных пар, Цель изобретения — расширение функциональных воэможностей способа за счет, увеличения расстояния между фрагментом

ДНК известной последовательнОсти и размножаемым фрагментом ДНК неизвестной последовательности.

Цель достигается тем, что после выделения ДНК из исследуемого объекта проводят дополнительную обработку ДНК крупнощепящей рестриктазой, сайт рестрикции которой RO присутствует во фрагменте ДНК известной последовательности, а сайты рестрикции R1 и R2 лежат между сайтом рестрикции R0 и фрагментом ДН К неизвестной последовательности; и последующее легирование полученной смеси для получения кольцевых молекул ДНК, В результате этой процедуры фрагмент

ДНК неизвестной последовательности, расположенный на расстоянии, ойределяемым расстоянием между сайтами рестрикции R0, оказывается непосредственно примыкающим к фрагменту ДНК известной последовательности (фиг. 2), К такой конструкции в принципе можно применить способ прототипа для размножения полимеразной цепной реакцией фрагмента ДНК неизвестной последовательности, непосредственно примыкающего к фрагменту ДНК известной последовательности.

Совокупность отличительных .признаков в литературе не описана, Использование изобретения позволяет расширить функциональные возможности способа за счет увеличения расстояния между фрагментом ДН К известной последовательности и размножаемым фрагментом

ДНК неизвестной последовательности, Расстояние между фрагментом ДНК известной последовательности и раэмножаемым фрагментом ДНК неизвестной последовательности при использовании способа прототипа равно нулю, тогда как при использовании

5 способа изобретения расстояние между фрагментом.ДН К известной последовател ьности и размножаемым фрагментом ДНК неизвестной последовательности может достигать нескольких десятков тысяч нуклеотидных пар, Этот факт делает возможным эффективное использование способа, предложенного в изобретении, для поиска неизвестных генов в рамках стратегии "обратной генетики". В типичном случае для поиска гена необходимо размножить и изучить несколько десятков фрагментов ДНК, расположенных примерно равномерно в области, размеры которой составляют несколько десятков — несколько сотен тысяч нуклеодит20 ных .пар. Таким образом, способ, предложенный в изобретении, по своим функциональйым возможностям сравним с использованием методов прогулки по хромосоме и прыжка rio хромосоме, но в связи с использованием цепной полимеразной реакции, является значительно более деше- вым, простым и не требует дорогостоящегс оборудования.

Пример. Для проверки заявленного

30 способа мы применили его к 5 концевой области гена дистрофина человека, последовательность которой была известна (рис.

3).

Были синтезированы олигонуклеиодит35 ные праймеры следующей последовательности ДНК; первый 5ATATAAGGTTGTG CTTCCAG CATAACAAG, второй — 540 GTGCGCAGGTCCTGGAATTTGAAATATCCG

При этом первый праймер мог гибридизоваться с участком ДНК между cBATOM рестрикции R2 рестриктазы Nco 1(сайт 749) и сайтом рестрикции R1 рестриктазы EcoR

45 (сайт 701) в нативной ДНК до обработки рестриктазами, и мог обеспечивать синтез

ДНК в йаправлении сайтов рестрикции R1 рестриктазы EcoR .t(сайты 701 и 315) в нативной ДНК до обработки рестриктазами, 50 а второй праймер мог гибридизоваться с участком ДНК между сайтом рестрикции

R2 рестриктазы Nco .! (сайт 749) и сайтом рестрикции RO рестриктаэы Nla! Ч (сайт 836) в нативной ДНК до обработки рестриктаза55 ми, и мог обеспечивать синтез ДНК в направлении противоположном тому, в котором мог обеспечивать синтез ДНК первый праймер, ДНК была выделена йз крови по следующей схеме, первая стадия состояла в пол1792972 уч тво про бе об

Nl ин ле

B чт дл ос

P5I

10 ст ро ме

NI об эт

Фр

Фр ро ем чт дл1 ос ря

30

R2 ме

Nl ре

35 нии ядер, затем проводили лизис в расре, содержащем 0,5% SDS и 100 ед/мл теиназы К, и фенольную экстракцию ков.

10 мкг геномной ДНК в объеме 100 мкл абатывали 40 единицами рестриктазы

IV в течение ночи при 37 С, Рестриктазу гибировали 10 мин при 65 С. Тупые концы ировали 500 единицами Т4 ДНК-лигазы бьеме 1 мл при 21 С в течение носи с тем, бы интересующие нас фрагменты ДНК ной 693 нп замкнулись в кольца. ДНК ждали в присутствии 0,4 М LiCI и раствои в 80 мкл ТЕ рН 8,0, ДНК обрабатывали 50 единицами реиктазы Есор I (сайты рестрикции котоR1 (сайты 315 и 701) располагались ду сайтами рестрикции RO рестриктазы

И (сайты 143 и 836) в нативной ДНК) в еме 100 мкл в течение ночи при 37 С, при м от интересующего нас кольцевого гмента ДНК длиной 693 нп отщеплялся гмент длиной 386 нп, Ликие концы легиали 50 единицами Т4 ДНК-лигазы в обь0,7 мл при 21 С в течение ночи с тем, бы интересующие нас фрагменты ДНК ной 307 нп замкнулись в кольца. ДНК ждали в присутствии 0,4 М LiCi и раствои в 50 мкл TF рН 8,0.

ДНК обрабатывали 60 единицами реиктаз Nco I (сайт рестрикции которой

{сайт 749) в нативной ДНК располагался ду сайтом рестрикции RO рестриктазы

IV (сайт 836) с одной стороны и сайтом трикции R1 рестриктазой EcoR I (сайт

), за которым на большем удалении от! Формула изобретения

Способ амплификации фрагмента ДНК неизвестной последовательности, расположенного на некотором расстоянии от фраг-!. мента ДНК известной последовательности, ! включающий синтез олигонуклеотидных праймеров, получение линейных фрагмен. I тов ДНК, в которых фрагмент ДНК неизвестной последовательности фланкирован фрагментами ДНК с известной последовательностью путем выделения ДНК из исследуемого обьекта, обработки ДНК ме4кощепящей рестриктазой, сайт рестрикции которой R1 присутствует во фрагменте

ДНК известной последовательности, легирование полученной смеси, обработку ДНК

I кру пнощепящей рестриктазой, сайт рестрикции которой R2 находится в известной последовательности на большем удалении от фрагмента ДНК неизвестной последовательности, чем сайт R1. или путем нагревасайта R2 следовали последовательно еще один сайт рестрикции R1 (сайт 315) и сайт рестрикции RO (сайт 143), с другой стороны), в объеме 100 мкл в течение ночи при 37 С, при этом происходило "раскрытие" интересующего нас кольца.

Затем была проведена полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием первого и второго праймеров, по следующей схеме: 1,0 мкг подготовленной (обработанной тремя рестриктазами) ДНК, 0,05 иМ каждого праймера, 200 иМ каждого dNTp в

50 мкл стандартного буфера для ПЦР (50 mM

KCI, 10 mM Tris рН 8,4, 2,5 mM MgCI2, 200 мкг/мл желатитны) прогревали 10 мин при 95

С, добавляли 2 ед, Taq-полимеразы, и проводили 38 циклов с параметрами; 95 С вЂ” 1 мин., 56 С вЂ” 1 мин., 68 С вЂ” 2 мин., затем добавляли дополнительно 2 ед. Tag-полимеразы и 0,5 иМ каждого праймера, проводили еще 14 циклов с теми же параметрами и финальную инкубацию при 68 С в течение 8 мин, Амплификацию проводили без минерального масла, после каждых семи циклов пробирки центрифугировали для осаждения конденсата, В результате описанных процедур был амплифицирован фрагмент ДН К ожидаемой длины 242 нп, который включал в себя фрагмент ДНК расположенный в нативной ДНК между сайтами рестрикции RO рестриктазы

Nla И {сайт 143) и R1 рестриктазы EcoR ( (сайт 315) и удаленный в нативной ДНК на некоторое расстояние от области ДНК, с которой могли гибридизоваться первый и второй праймеры. ния раствора ДНК для производства статистических разрывов I: кольцевых ДНК с последующим и роведением реакции полимеризации с использованием фрагмента ДНК неизвестной последовательности и праймеров, отличающийся тем, что, с целью расширения функциональных возможностей способа за счет увеличения расстояний между фрагментами ДНК известной последовательности и размножаемым фрагментом ДНК неизвестной последовательности, после выделения ДНК из исследуемого объекта проводят дополнительную обработку ДНК крупнощепящей рестриктазой, сайт рестрикции которой RQ присутствует во фрагменте ДНК известной последовательности, а сайт рестрикции R1 и R2 лежат-между сайтом рестрикции RQ u фрагментом ДНК неизвестной последовательностй и легирование полученной смеси для получения кольцевых молекул ДНК, 1792972

4 б б

Ф

1261 1271 1281 1291 1301 1311

ATATATATGThTTTATTCAGGAATATATATÒÒTÒCATTGGGAAAACTТТТСАЛ AGhhAT е t э Ф

1321 1331 1341 1351 1361 . 1371

ООАОТОТАЬЛАОТТТТТСТТТОСОАТАОААСТАААСАСАТОАТТТСТТОЛТТААСАААСС

1381 1391

ACTGCAGCCCGG

Рестиктаэа . узнаваеная нослеловательность сайтц узнавания

313, 701

143, 836

749

Ec0RI

NlaIV

GAATTC

ООЯЯСС

CCATGG

NcoI

ФЫР. 3

Составитель О.Евграфов

Техред М,Моргентал Корректор С,Пекарь

Редактор

Заказ 482 . Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Ю/ и а&тею „гий ю ааязиМ

Ю

) гигцпа3ание

AZ

1 ЯРйаВКО 4Ж

Ю1 Ф па соутуй2 ю Ф р аю

8Z

Рог,/ 05ра5отка,6НХоо сайааМ е юг.пг и Ау

7) ) ЯигираЬше

Р %+A 2

1Ю

) 06райотко ДНЯ посойауИ и, Амллификоция ог

Иа. е