Способ получения иммуногемосорбента

 

Изобретение относится к медицине, в частности к способу получения иммуногемосорбента. Целью изобретения является повышение удельной сорбционной емкости и спектра иммуноглобулинов. Иммунотемосорбент получают путем нанесения иммуноглобулинов на матрицу, для чего через нее перфузируют водный раствор иммуноглобулинсодержащей сыворотки, подвергнутый обработке в катодной камере при силе тока 50-60 мА в течение 30-40 мин. Использование изобретения позволяет повысить удельную сорбционную емкость и спектр наносимых на матрицу иммуноглобулинов более чем в два раза, причем позволяет наносить иммуноглобулины сыворотки, минуя стадию их выделения, а после иммобилизации термическим способом придает иммуногемосорбенту способность адсорбировать антитела к иммуноглобулинам. Использование заявляемого способа в эксперименте на животных путем проведения маятниковой иммуногемосорбции позволяет повысить устойчивость животных к аллергическому медиатору гистамину в три раза. 1 ил, 4 табл. со с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (505 А 61 К 45/05

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4846712/14 (22) 06.07,90 (46) 28.02.93. Бюл. ¹ 8 (71) Всесоюзный научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники (72) Ф.И. Котков, О.А. Машков, И.Л. Лир, В.M. Бахир и В.И. Прилуцкий (56) Карлин Н.Н, и др. Метод повышения сорбционной емкости активированного угля по отношению к стафилококковому токсину. — Лабораторное дело, 1979, ¹ 9, с. 546—

547. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕМаC0PGEHTA (57) Изобретение относится к медицине, в частности к способу получения иммуногемосорбента. Целью изобретения является повышение удельной сорбционной емкости и спектра иммуноглобулинов. ИммуногемоИзобретение относится к медицине, в частности, к способу получения иммуногемосарбента. "

Целью изобретения является повышение удельной сорбционной емкости и спектра наносимых на матрицу иммуноглобулинов, которыj после иммобилизации могли бы служить . лигандом иммуногемосорбента.

Пример 1. Готовят рабочий раствор сыворотки кровичеловека иэ расчета 1 часть сыворотки и 3 части физиологического раствора, Полученный раствор. взятый в обьеме

100 см, подвергают униполярной катодной

3 обработке в проточном режиме s описанном выше устройстве при силе тока 50 мА.

„„!И „, 1797896 А1 сорбент получают путем нанесения иммуноглобулинов на матрицу, для чего через нее перфуэируют водный раствор иммуноглобулинсодержащей сыворотки, подвергнутый обработке в катодной камере при силе тока 50-60 мА в течение 30 — 40 мин. Использование изобретения позволяет повысить удельную сорбционную емкость и спектр наносимых на матрицу иммуноглобулинов более чем в два раза, причем позволяет наносить иммуноглобулины сыворотки, минуя стадию их выделения, а после иммобилизации термическим способом придает иммуногемосорбенту способность адсорбировать антитела к иммуноглобулинам.

Использование заявляемого способа в эксперименте на животных путем проведения маятниковой иммуногемосорбции позволяет повысить устойчивость животных к аллергическому медиатору гистамину в три раза.

1 ил, 4 табл. перфузируя этот раствор через 200 см гемосорбента.СКН 4М с помощью роликового насоса. Время рециркуляции раствора

30 мин. Обьемное соотношение пропускаемого раствора и матрицы равно 1:3.

Обработанную таким образом матрицу освобождают от раствора, сушат, отмывают и используют для проведения исследований.

Результаты проведенных испытаний в сравнении с прототипом и контролями приведены в табл. 1 и 2.

Использование заявляемого способа позволяет, по сравнению с прототипом, наносить на матрицу почти все классы иммуноглобулинов, что расширяет ассортимент

1797896

40

55 наносимых антител. Причем, удельная сорбционная емкость гемосорбента (матрицы) относительно иммуноглобулинов при катодной обработке увеличивается более чем в 2 раза. Кроме того, отпадает необходимость перед получением иммуногемосорбента выделять из сыворотки иммуноглобулины для дальнейшего использования их в качестве иммунолиганда, Кроме того, отпадает необходимость перед получением иммуногемосорбента выделять из сыворотки иммуноглобулины для дальнейшего использования их в качестве иммунолиганда..

Пример 2. Выполнение лабораторного опыта иммуногемосорбции с использованием полученного иммуногемосорбента.

Матрицу (готовый углеродный гемосорбент марки "ФАС" обрабатывают сывороткой крови человека согласно примера 1.

После этого гемосорбент с нанесенными на него иммуноглобулинами отмывают от неадсорбировэнных белков с помощью физиологического раствора. Далее полученный сорбент подвергают термической обработке при температуре выше 100 С до полного высушивания. При такой термической обработке происходит фиксирование и денэтурация нанесенных на матрицу белковых веществ (иммуноглобулинов). Полученный гемосорбент еще раз отмывают физиологическим раствором и используют для проведения испытаний.

Гемосорбент после сливания физиологического раствора смешивают с pBBHblM обьемом содержащей антитела к определенному иммуноглобулину сывороткой (моноспецифической сывороткой), разведенной предварительно в 5 раз. Для контроля аналогичный обьем гемосорбента (ФАС), не подвергнутого модификации предлагаемым способом, смешивают в тех же соотношениях с моноспецифическими сыворотками, Испытывают адсорбционную способность опытного и контрольного образца сорбентов к имеющимся в наличии моноспецифическим сывороткам (анти- IgG, анти-IgA, анти-IgM). С каждой антисывороткой для количественного выражения результатов адсорбции, ставят титрованную реакцию Манчини, причем, титруют не плазму человека, как общепринято, а саму антисыворотку. Делают разведения антисыворотки 1:5, 1:10, 1:20, 1.40. Каждое разведение пополам смешивают с расплавленным агаром и наносят по 3 мл на предметные стекла. На каждом стекле с агаром делают ряд лунок общепринятым методом. В каждую лунку вносят по 3 микролитра цельной сыворотки человека. Учет результатов производят на следующий день, через 18 часов. В результате получают ряд предметных стекол, для каждой антисыворотки, для каждого ее разведения свое стекло и каждому разведению антисыворотки соответствовал свой диаметр кольца преципитации. На основании соответствия разведения антисыворотки и квадрата диаметра преципитационного кольца вычерчивают калибровочную кривую, Имея такую кривую. легко установить, насколько уменьшается концентрация антител к конкретному иммуноглобулину после взаимодействия антисыворотки с контрольным гемосорбентом или иммуногемосорбентом, Исследование истощенных сорбентами моноспецифических сывороток производили после перемешивания их в аппарате для встряхивания в течение 30 мин. Результаты проведенных исследований представлены в табл. 3.

Результаты исследований, представленные в таблице, показывают, что после закрепления на матрице денатурированного иммуноглобулиносодержащего лигэнда к присущей матрице способности изымать из сыворотки антитела к иммуноглобулину "G" присоединяется свойство адсорбировать ан-. титела к IgA. а также наиболее активно связывать и антитела к иммуноглобулину "М", причем эта способность выражена вдвое сильнее, чем к иммуноглобулину "G".

Пример 3. Выполнение иммуногемосорбции на кроликах с использованием полученного иммуногемосорбента, Готовят иммуногемосорбент согласно примера 1 и 2. Затем расфасовывают во флаконы, заливая небольшим количеством физиологического раствора, рН 7,0 и подвергают автоклавированию при 1,2 атм в течение 1 часа. Для проведения контрольных опытов в качестве лиганда используют альбумин человека (10% раствор). Особенность нанесения альбуминового лиганда на матрицу заключалась в том, что полярность электрического тока, используемого для обработки раствора альбумина,меняли на противоположную. Остальные операции проведены согласно примера 1 и 2.

Гемосорбент (опытный и контрольный образцы) после сливания физиологического раствора промывают физиологическим раствором, содержащим гепарин (5 тыс, ед. на 100 мл оаствора). Далее в шприц емкостью 10 см набирают 3 см гемосорбента, пунктируют краевую вену кролика и заполняют шприц до 10 мл кровью. После

10-минутного взаимодействия гемосорбента с кровью осуществляют возврат крови в вену животного, 1797896

Таблица 1

Условия получения иммуносорбентов

* Иммуносорбент получен без эмктрообработки раствора сыворотки, Никаких патологических реакций после возврата крови не отмечается. Через 2 часа и ро веря ют устойчивость животных (on ытных и контрольных) к смертельной дозе

0,1 Д раствора гистамина гидрохлорида. Аб солютная смертельная доза этого медиатора для кроликов устанавливается в предварительных опытах. Она равнялась в наших опытах для кроликов весом 3 кг 2,1 мл внутривенно введенного раствора или

0,7 мл на 1 кг веса.

Результаты испытаний гемосорбентов представлены в табл. 4.

Результаты исследований. представленные в таблице, показывают, что предлагаемый иммуногемосорбент по сравнению с контрольным гемосорбентом с неиммуноглобулиновым белковым лигандом повышает устойчивость кроликов к смертельной дозе аллергического медиатора гистамина, что подтверждается трехкратным увеличением выживаемости животных, подвергнутых маятниковой иммуногемосорбции, от токсического медиатора гистамина.

Использование заявляемого способа позволяет наносить иммуноглобулины на матрицу в достаточно большом количестве, минуя предварительную стадию выделения иммуноглобулинов иэ сыворотки, значительно увеличивает спектр наносимых на матрицу иммуноглобулинов, à npi. иммобилизации нанесенных иммуноглобулинов с помощью повышенной температуры (100120 С) придает способность адсорбировать антитела к иммуноглобулинам.

5 Учитывая широкую доступность метода стерилизации (автоклавированием) и и ротивоаллергическое действие за счет трехкратного повышения устойчивости животных к гистамину позволяет использовать получен10 ный иммуногемосорбент для проведения клинических испытаний, Кроме того, заявляемый способ является экологически чистым, так как позволяет наносить иммунолиганд на матрицу беэ

15 применения каких-либо химических реагентов, а при использовании термического способа иммобилизации исключает применение и токсических реагентов, например, глутарового альдегида.

Формула изобретения

Способ получения иммуногемосорбента, включающий инкубацию гемосорбента с последующей его отмывкой, о т л и ч а ю25 шийся тем, что, с целью повышения удельной сорбционной емкости и спектра иммуноглобулинов, сыворотку перед инкубацией дополнительно обрабатывают в катодной камере при силе тока 50 — б0 мА в

30 .течение 30 — 40 мин. а инкубацию проводят в проточном режиме.

1797896

Таблица 2

Свойства полученных иммуносорбентов

Содержание иммуноглобулинов в послесорбционном растворе, мг/мл

Спектр наносимых на матрицу иммуноглобулинов

Сорбционный аффект, %

Удельная сорбционнэя емкость мг/см сорбентаматрицы

Пример

IgM

IgA

IgG

IgA IgM

IgJ

0,90 0,20

2,7

Исход. раст.

0.12

IgG, IgA, IgM

0,13

IgG, IgA IgM

0,14

IgG, IgA, lgM

0,12

lgG, IgA, IgM

0,03

IgG, IgA, IgM

Ig G

0,08

IgG, IgA lgM

0,10

IgG, IgA, IgM

0,03

1 G

60

0,016

0,.1 9 0,36 0,05

0,016

0,20 0,30 0,04

0,15 0.38 0,04

0.18 0,35 0,06

0,016

80

93

67

0,016

0,0067

1,30 0,90 0,20

Прототип

Контроль1

Контроль 2

Конт оль 3

0,016

0,80 0,50 0,15

0,18 0,37 0,05

44

0,016

0,0067

93

0,20

1,35 0,90

Таблица 3

Таблица 4

Выживаемость кроликов после проведения маятниковой гемосорбции на опытном и контрольном гемосорбентах

Испытание адсорбционной способности иммуногемосорбента и матрицы относительно антииммуноглобулиновых антител моноспецифических сывороток

Редактор

Заказ 728 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Вс

ЭЛ

1797896

I 2

Составитель Ф. Котков

Техред М.Моргентал Корректор Т; Палий

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101