Ингибитор размножения вируса иммунодефицита человека

 

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии. Цель изобретения - повышение специфической анти-ВИЧ активности . Для этого используют пента-0-никотинат глицирризиновой кислоты в качестве вещества, проявляющего свойства ингибитора размножения вируса иммунодефицита человека. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s А 61 К 31/705

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ CCCP) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4897692/14 . (22) 29.12,90 (46) 30.03.93. Бюл. йв 12 (71) Научно-производственное объединение

"Вектор", Институт химии Башкирского научного центра Уральского отделения

АН СССР (72) А.Г.Покровский, О.А.Плясунова, Л.А.Цалтина, Г.А.Толстиков и Ю.И.Муринов (56) С.М.Коломиец. Н.Д.Коломиец "Современные возможности терапии СПИДа", ж,:

Здравоохранение Белоруссии, 1988, М 1, с. 47.

Изобретение относится к области вирусологии, медицины, а именно, к разработке и поиску новых противовирусных препаратов, обладающих анти- ВИЧ активностью.

Цель изобретения — расширение спектра противовирусных препаратов, обладающих анти-ВИЧ активностью.

Поставленная цель достигается применением пента-О-никотината глицирризиновой кислоты, 3-ф D-2,3,4-три-О-никотинилглюкуронопиранозил)1 - 2(а-0-3,4-ди-Оникотинил-глюкуронопиранозид глицирретовой кислоты (ниглизина) в качестве ингибитора размножения вируса иммунодефицита человека.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Первично инфицированные ВИЧ-1 и

ВИЧ-2 клетки МТ-4 или хронически инфицированные ВИЧ-1 клетки Э В К-ИРА/3 культивируют в присутствии препарата ниглизина, конечная концентрация которого в культуральной среде составляет 0,5 — 1,0 мгlмл и без него (контроль) на протяжении одного пассажа — в течение 4-х суток. Об ингибиро„„Я „„1804848 А1 (54) ИНГИБИТОР РАЗМНОЖЕНИЯ ВИРУСА

ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА (57) Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии. Цель изобретения— повышение специфической анти-ВИЧ активности. Для этого используют пента-О-никотинат глицирризиновой кислоты в качестве вещества, проявляющего свойства ингибитора размножения вируса иммунодефицита человека. 2 табл, вании репродукции ВИЧ в клетках судят по снижению активности обратной транскриптазы в культуральной жидкости и накоплению вирусного антигена (по данным иммуноферментного анализа) на 4-ые сутки культивирования по сравнению с контролем. Ингибирующий эффект ниглизина сравнивают с анти-В ИЧ действием азидотимидина и Р-глицирризиновой кислоты — известных ингибиторов репродукции ВИЧ.

Предлагаемое изобретение обладает существенными отличиями; т.к, авторами впервые установлена способность ниглизина ингибировать репродукцию ВИЧ (ВИЧ-1 и ВИЧ-2) в культуре клеток, не известная ранее. Приведенные ниже конкретные примеры подробно раскрывают сущность изобретения.

Пример 1. Изучение влияния пентаО-никотината глицирризиновой кислоты (ниглизина) на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4.

Суспензия инфицированных ВИЧ-1 клеток MT-4 с концентрацией 5 х 10 клеток/мл в питательной среде RPMT — 1640. содержа1804848 щей 10 сыворотки плода коровы, 0,06® глутамина, антибиотики, вносят автоматической пипеткой в лунки 96-луночного культурального планшета по 200 мкл в каждую.

Затем в контрольные лунки вносят по 2 мкл

ДМСО, а в остальные лунки вносят по 2 мкл раствора ниглиэина в ДМСО с концентраци-. ями 100 мг/мл и 50 мг/мл до конечной концентрации ниглизина в культуральной среде, 1,0 мг/мл и 0.5 мг/мл, соответствен«о (берут не менее 3-х лунок на каждый вариант), В несколько пустых лунок вносят для контроля по 200 мкл суснензии неинфицированных клеток МТ-4 с концентрацией 5 х 10" клеток/мл. 15

Планшет закрывают и инкубируют во влажной камере СО -инкубатора с 5; углекислого газа при температуре (36-37) С в течение 4-х суток.

По окончании инкубации контролируют 20 уровень вируспродукции иммуноферментным методом и методом определения активности обратной транскриптазы. Подготовку образцов для ИФА осуществляют инактиви- . руя БИЧ-1 добавлением к пробе твина-80 до конечной концентрации 0,1 g с последующей инкубацией при температуре (6= 2) С в те .ение не менее 24 ч. Из приготовленных таким образом проб готовят ряд последовательных двукратных разведений, которые за- 30, тем вносят попарно по(100й1) мкл в лунки сенсибилизировенных планшетовтест-системы "Вектор" или "Abbott", Дальнейшие операции и учет результатов проводят в соответствии с инс.грукцией по применению 35 тест-системы, За титр вирусного антигена принимают то конечное разведение исход. ного материала, в котором достоверно выявляется антиген ВИЧ-1. Ингибирующий. эффект оценивают по отношению титров ви- 40 русного антигена в исследуемой пробе и . контроле (без добавления препарата).

Уровень вируспродукции оценивают так>ке по BKTMBHQGTH обратной транскриптаэы, За активность обратной транскриптазы 45 принимают включение радиоактивной метки в импульсах на 1 мл культуральной жидкости. Ингибирующий эффект оценивают no отношению актлвности обратной транскриптазы в исследуемом образце и контро- 50 ле (без давления препарата}.

Количество живых клеток в исследуемом образце и в контролях определяют с помощью камеры Горяева после окрашивания клеток 0,4 -ным раствором трипаново- 55 го синего, Результаты представлены в таблице 1.

Пример 2. Изучение влияния пентаО-никотината глицирризиновой кислоты (ниглизина) на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток ЭВК-ИРА/3, Суспенэию хронически инфицированных ВИЧ-1 клеток ЭВК-ИРА/3 с концентрацией 5,5 х 10 клеток/мл в питательной среде RPMI-1640, содержащей 15 сыворотки плода коровы 0,067 глутамина, антибиотики, вносят автоматической пипеткой в лунки 96-луночного культурального планшета по 200 мкл в каждую. Далее эксперимент проводят как описано в примере 1.

Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Пример 3. Изучение влияния азидотимидина на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4.

Суспенэию инфицированных ВИЧ-1 клеток MT-4 с концентрацией 5,6 х 10 клеток/мл в среде RPMI 1640, содержащей

1007 сыворотки плода коровы, 0,06 глутамина, антибиотики, вносят автоматической пипеткой по 180 мкл в каждую лунку 96-луночного культурального планшета. Затем в контрольные лунки вносят по 20 мкл ростовой питательной среды, à е остальные лунки вносят по. 20 мкл раствора азидотими- . дина в питательной среде с концентрацией

100 MKf /MR до конечной концентрации азидотимидина в культуральной среде 10 мкг/мл.

Далее поступают так же, как описано в примере 1. Результаты приведены в таблице 1, Пример 4. Изучение влияния азидотимидина на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток ЭВК-ИРА/3.

Суспензию хронически инфицированных ВИЧ-1 клеток ЭВК-ИРА/3 с концентрацией 0,6. х 10 клеток/мл в питательной среде RPMI-1640, содержащей 15;ь сыворотки коровы, 0,06 g, глутамина, антибио- . тики, вносят автоматической пипеткой по

180 мкл в каждую лунку 96-луночного культурального планшета, Далее поступают так же, как описано в примере 3. Результаты влияния Р-глицирризиновой кислоты на репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4.

Суспензию инфицированных ВИЧ-1 клеток МТ-4 с концентрацией 5 х 10 клеток/мл в питательной среде RPMI-1640, содержащей 10$ сыворотки плода коровы, 0,06% глутамина, антибиотики, вносят автоматической пипеткой в лунки 96-луночного культурального планшета по 200 мкл s. каждую, Затем в контрольные лунки вносят по

2 мкл 96 этилового спирта, а в остальные лунки вносят по 2 мкл растворов Р-глицерриэиновой кислоты в 96 этиловом спирте с концентрациями 100 мгlмл и 50 мг/мл до конечной концентрации/3-глицерризиновой

1804848 кислоты в культуральной жидкости 1,0 мг/мл и 0,5 мг/мл, соответственно. Далее поступают так же, как описано в примере 1. Результаты представлены в таблице 1.

Пример 6. Изучение влияния Р-глицирриэиновой кислоты на репродукцию

ВИЧ-1 в культуре клеток ЭВК-ИРА/3.

Супензию хронически инфицированных ВИЧ-1 клеток ЭВК-ИРА/3 с концентрацией 5,5 х 10 клеток/мл в питательной среде RPMI-1640, содержащей 15% сыворотки плода коровы 0,06 глутамина, антибиотики, вносят автоматической пипеткой в лунки 96-луночного культурального планшета по 200 мкл в каждую. Далее поступают так же, как описано в примере 5. Результаты представлены в таблице 2, Пример 7. Изучение влияния пента0-никотината глицирризиновой кислоты (ниглиэина) на репродукцию ВИЧ вЂ” 2 в кульгуре клеток.

В эксперименте используют суспензию инфицированных ВИЧ-2 клеток MT-4.с концентрацией 5 х 10 клеток/мл в питательной среде RPMI-1640, содержащей 10% сыворотки плода коровы, 0,06% глутамина, анти биотики. Эксперимент проводят так же, как описано в примере 1, Иммуноферментный, анализ проводят с тест-системой "Вектор" с использованием антигена ВИЧ-2, коньюгата иммуноглобулинов с пероксидазой хрена, полученных из сыворотки крови больного, инфицированного ВИЧ-2 и положительной сыворотки крови, содержащей антитела к ВИЧ-2. Результаты приведены в таблице 1. п р и м е р 8. Изучение влияния азидотимидина на репродукцию ВИЧ-2 в культуре клеток.

B эксперименте используют суспензию инфицированных ВИЧ-2 клеток MT-4 с концентрацией 5,6 х 10 клеток/мл в питательной среде RPMI-1640, содержащей 10 сыворотки плода коровы 0,06% глутамина, антибиотики, которую вносят автоматической пипеткой в лунки 96-луночного культурального планшета по 180 мкл в каждую.

Затем в контрольные лунки вносят по 20 мкл ростовой питательной среды. а в остальные лунки вносят по 20 мкл раствора азидотимидина в питательной среде с концентрацией

100 мкгlмл до конечной концентрации ази20 дает ингибирующего эффекта. Приведенные здесь экспериментальные данные убедительно показывают преимущества ниглизина по сравнению с азидотимидином (по токсичности) и с P rëèöèððèçèíoâoé

30 кислотой (по ингибирующему эффекту на культуре хронически инфицированных

ВИЧ-1 клеток).

Таким образом, применение пента-0никотината глицирризиновой кислоты (ниглизина) в качестве ингибитора ВИЧ-1 и

ВИЧ-2 позволяет расширить сгектр противовирусных препаратов для борьбы со

СПИД.

Наличие доступного отечественного

35 сырья и производственно-технологической базы в г. Уфе для производства ниглизина—.очень важное условие его изготовления, mrда как основное исходное соединение для синтеза азидотимидина тимидин (первона40 чально получаемый из икры лосося и сельди) производится десятистадийным синтезом американской фирмой "Pfizer". и в целом период с момента получения сырья до изготовления препарата составляет около семи

45 месяцев.

Формула изобретения

Применение пента-0-никотината гиацирриэиновой кислоты в качестве вещества, проявляющегося свойства ингибитора

50 размножения вируса иммунодефицита человека дотимидина в культуральной среде 10 мкг/мл. Далее поступают так же, как описано в примере 7. Результаты представлены в таблице 1.

5 Из таблиц видно, что ниглизин не уступает по эффективности ингибирования

ВИЧ-1 азидотимидину и даже превосходит его по эффективности ингибирования ВИЧ2 в культуре клеток, при этом не оказывая

10 токсического действия на клетки. При сравнении ингибирующего эффекта ниглизина и глицирризиновой кислоты видно, что оба препарата эффективно ингибируют размножение вируса в первично инфициро15 ванной ВИЧ-1 культуре клеток MT-4, однако в хронически инфицированной ВИЧ1 культуре клеток ЭВК-ИРА/3 ниглизин на

60-62% подавляет репродукцию вируса, в то время как Р-глицирризиновая кислота не

1804848

Таблица 1

Ингибировамие репродукции ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в культуре клеток МТ-4

Концентрация препарата,, мкгlмл

ВИЧ-1

ВИЧ-2

Наименование препарата .

Ингибирование накопления вирусмого энтигена, Количество живых клеток, ®

Количество живых клеток, ®

96,4М.9

99,3+0.1

98,3й0,8

96,6й0,4

96;7й0,4

35,52,4

11,6:2,8

49,4+13,7

38,5+3,7

П ри меч а н и е. Средние значения оценены по критерию Стьюдента для Р 0,5; н/о — не определяли

Таблица Ф

Ингибировамие репродукции ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в хронически инфицированной культуре клеток ЭВК-ИРА/3

Концентрация препарата, мкг/мл

Наименование препарата

Количество живых кле-ток, ф

Ингиби ование активности вирусной обратной транск иптаэы, накопления вирусного антигена, Азидотимидин

Р-глицирризиновэя кислота

ФФ

Э

Ниглизин

ФФ

Контроль (инфицированные клетки

4,8+0,4

18,2 1,8

10,5+ 6,5 н/о

49,422.4

13,83,2

57,4й2,1 нет эффекта. нет эффекта

66,4М,2

65 9й1 9

55,7й0,4 нет эффекта н/о

60,1 й4,9

61,8й16,6

Il p и м е ч а н и е. Средние значения оценены по критерию Стьюдентэ для P-0.5: н/о — не определяли

Составитель А. Покровский

Техред М.Моргентал Корректор.Л. Филь

Редактор

Заказ 912 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат, "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101

Аэидотимидин

Р-глицирризиновая кислота

° Ф

Ниглизин

ФФ

Контроль (инфицированные клетки)

Контроль (неинфицировэнные клетки) 10 1000

500

1000

500

500

6,022,0

11,4й7,6

18,2ЩОО

35,9+5,9 н/о

5,622 4 н/о н/о

33,3М.6 н/о

Ингибировэние на-: копления вирусмого антигена,80,13.3 н/о н/о

91,8й1,1

86,В1О,1