Штамм гриба аlтеrnаriа solani sorauer, используемый для селекции томатов на устойчивость к альтернариозу

 

Использование: сельское хозяйство, селекция томатов на устойчивость к альтернариозу. Сущность изобретения: штамм микромицета Alternaria solani Sorauer выделен из растения томата. Депонирован в В КМ под № Р3236Д. Штамм выращивают глубинно на среде Чапека-Докса, затем фильтруют культура льну ю жидкость, подкисляют до рН 3,0-3,5, экстрагируют равным объемом хлороформа . Полученный экстракт штамма используют для селекции томатов на устойчивость к альтернариозу. 2 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st>s A 01 N 63 вают чение тивинной

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

В ЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4813220/13 (22) 10,04.90 (46) 30.05.93. Бюл. М 20 (71) Институт экологической генетики АН

МССР и Институт биоорганической химии им. M.Ì. Øåìÿêèíà (72) 0.6,Дараков, Л.Г.Мелиян и В.В.Оноприенко (56) Мелиян Л,Г. и др, Действие токсичных метаболитов Alternarla solanl на прораста. ние пыльцы и семян томатов. Сборник "Влияние фитопатогенов на репродуктивную систему растений-хозяев". Кишинев, 1989, с. 65-65, Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к селекции томатов на устойчивость к ранней листовой пятнистости.

Цель изобретения — штамм гриба, предназначенный для повышения устойчивости томатов к альтернариозу, Описание штамма ВКМ F — 3236 Д.

Штамм выделен из растения томата

Lycopersicon esculentum Mill, сорта "Ранний

83" в теплице с пленочным покрытием Молдавского НИИ овощеводства.

Штамм был выделен путем снятия одной диктиоспоры (диктиоконидии) гриба с инфекционного пятна при помощи стерильной тонкой иглы и перенесения споры на стерильное агаризованное пивное сусло.

Штамм идентифицирован по определителю: Ellis М, Dematiaceous Hyphomycetes.

Kew: Commonwealth Agric. Bureou, 1971. (54) ШТАММ ГРИБА ALTERNAZlA SOLANl

S0RAUER, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ СЕЛЕКЦИИ ТОМАТОВ НА УСТОЙЧИВОСТЬ К

АЛЬТЕРНАРИОЗУ (57) Использование: сельское хозяйство, селекция томатов на устойчивость к альтернариозу. Сущность изобретения: штамм микромицета Alternaria solanl Sorauer выделен из растения томата. Депонирован в ВКМ под М F-3236Д. Штамм выращивают глубинно на среде Чапека-Докса, затем фильтруют культуральную жидкость, подкисляют до рН

3,0 — 3,5, экстрагируют равным объемом хлороформа. Полученный экстракт штамма используют для селекции томатов на устойчивость к альтернариозу. 2 табл

Для использования штамм выращи на жидкой среде Чапека-Докса в те

12-70 суток. Минимальное время куль рования используют в случае погруже культуры, например, на роторных встряхи вателях. Максимальное время роста используют в случае стационарной культуры.

Для уверенной идентификации штамм

его выращивают на живых листьях томатов;

Мицелий осторожно втирают в листья и оставляют во влажной камере при обычных условиях и рассеянном дневном освещении на срок 10 — 14 суток. При этом на листьях образуются инфекционные пятна, некоторые из которых покрыты редкими диктиоконидиями, типичными для вида.

Для поддержания культуры в обычных лабораторных условиях, ее выращивают на стандартных агаризованных питательных средах, например, сусло-arape, При этом идентифицируют па серой окраске мицелия, 1818041 темной окраске низа колоний (причем, пигмент часто диффундирует в питательную среду), а также присутствию (редкому) спороношений. Главным признаком штамма

В КМ F — 3236 Д, отличающим его от других штаммов вида Alternaria solanl, является спектр липофильных низкомолекулярных экэометаболитов, который можно определить с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Особенности спектра описаны ниже.

Культурально-морфологические свойства

Характеристика колоний на плотной среде, 15

При росте на стандартной среде Чапека при 24 С колонии штамма имеют морфологию, типичную для данного аида: колонии широкорастущие, за 8 — 10 суток роста диаметр достигает 40 мм, эа 60 суток — 220-250 20 мм. Колонии темно-серые с оливковым оттенком, поверхность стареющих культур часто приобретает белесый налет с каплями бесцветного экссудата, На агаризованном пивном сусле этот экссудат имеет янтарную 25 окраску. При росте на жидких и агаризованных средах часто выделяется темный пигмент, который диффундирует в среду.

Тип вегетативного тела — мицелий.

Субстратный мицелий. 30

Среда, Т, возраст,.условия роста: сусло-агар, 20 С, 10 суток, рост мицелия из одной диктиоконидии, выделенной с листа томата при искусственном заражении.

Гифы под микроскопом темно-окрашек- 35 ный, септированные, диаметром 4 — 10 мкм, анастомозирующие, иногда встречаются хламидоскопы. При росте мицелия издиктиоконидий субстратный мицелий образует микросклероции. 40

Воздушный мицелий.

Среда, Т, возраст, условия роста: сусло-агар, 20 С, 10 суток, рост мицелия из диктиоконидии.

При моноспоровом рассеве воздушный 45 мицелий встречается не у всех иэолятов, Цвет воздушного мицелия оливково-серый, гифы в части, прилегающей к субстрату, темно-окрашенные, их воздушные концы часто бесцветные. Иногда встречаются вздутые 50 клетки овальной формы, а также хламидоспоры. Гифы септированные.

Тип размножения.

Вегетативное (обломками мицелия) и 55 кон идиал ь ное.

Покоящиеся структуры.

Микросклероции, хламидоспоры, диктиоконидии, алевриоконидии.

Бесполое размножение.

Типичные диктиоконидии образуются на листьях томатов при искусственном заражении. Они имеют форму тонкой морковки с длинным отростком. Наиболее крупные конидии достигают 250 — 300 мкм в длину, считая вместе с отростком, и 20-25 мкм в диаметре. В культуре также изредка образуются диктиоконидии; главным образом по краям чашек Петри, в местах контакта мицелия и стенок чашек. Диктиоконидии в культуре имеют меньшие размеры и часто деформированы, либо редуцированы до цепочки хламидоспор, Конидиеносцы морфологически не выражены.

Хламидоспоры — интеркалярные, темноокрашенные, — довольно часто образуются в культуре. Они могут встречаться поодикочке, либо образовывать цепочки и сростки.

Алевриоконидии (ранее у данного вида не отмеченные) имеют сферическую форму, диаметр 30 — 40 мкм, орнаментированную поверхность.

Артроконидии (ранее у данного вида не отмеченные) образуются по голоартрическому типу, и их трудно отличить от форагментов мицелия.

Последние два типа конидий встречаются в культуре крайне редко, и обнаружить их при обычном микроскопическом исследовании, как правило, не представляется возможным, Кроме диктиоконидий, все типы спороношения могут образовываться в темноте, Половое размножение.

Не отмечено.

Физиолого-биохимические свойства.

Тип катаболиэма: дыхание.

Симбиотропные отношения: не выявлены.

Отношение к: кислороду — аэроб.

Температура роста: максимальная 3032 С„оптимальная — 20-424 С, минимальная не выявлена. рН: оптимальное значение 6-7, нормальный рост культуры наблюдается при значениях рН 4 — 8, ингибирующие рост значения рН не выявлены, Другие характерные физиологические особенности не выявлены, Маркерные признаки штамма и методы их выявления.

Маркерным биохимическим признаком штамма является состав экстракта, выявляемый, например, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Выявление маркерного признака про-. водят следующим образом. Культуру гриба выращивают на жидкой среде Чапека-Докса в погруженной культуре на роторных встря1818041 хивэтелях при 90 — 110 об/мин. Температура культивирования 20 — 22 С, срок — 12 — 16 суток. Затем отделяют культуральную жидкость, подкисляют ее до рН 3 — 3,5 и зкстрагируют хлороформом, После отгонки 5 растворителя на роторном испарителе при температуре баии 40 — 50 С получают остаток, называемый экстрактом. Идентификацию состава экстракта проводят с помощью

ВЭЖХ. ВЭЖХ осуществляют с помощью 10 хроматогрэфа PU 4100 на колонке с обращенной фазой Lichrosorb RP 18,5 мкм) размером 250х4,6 мм при температуре 400С в градиенте от смеси метанол-вада 1:5 до

1007 . метанола в течение40 мин при скоро- 15 сти растворителя 1 мл/мин. Полученные фракции идентифицируют при помощи спектрофотометрического детектора при длине волны 275 нм. При этом отдельные фракции маркированы по временам удер- 20 живания на колонке прибора (мин.); 2,31, 5,82, 14,29, 16,50, 19,06, 22,43, 23,95, 28,54, 31,54, 33,79.

Гено- и хематаксаномические характе-. ристики. Не имеются. . 25

Непатогенен для человека и животных, Пример 1. Штамм ВКМ F — 3236 Д выращивали в погруженной культуре на среде Чапека-Докса, В колбы Эрленмейера емкостью 300 мл наливают по 150 мл среды, 30 автаклавируют 40 мин при 0,5 — 0,6 атм. иэбыточнога давления, затем после охлаждения инокулируют мицелиальными дисками диаметром 10 мм. Диски вырезают.у краев семи-десятисуточных колоний гриба, вы- 35 росших на агэризованном пивном сусле.

Колбы с грибом помещают на роторные встряхиватели WU — 4 при интенсивности встряхивания 90 — 120 об/мин. Спустя 12 суток инкубэции купьтуральную жидкость от- 40 фильтравывают, подкисляют до рН 3-43,5 и экстрагируют равным объемом хлороформа. После отгонки хлороформа на роторном испаритепе получа ют экстракт штамма 8 KM

F — 3236 Д, который используют в селекции 45 томатов нэ устойчивость к альтернариозу.

Семена томатов сортов Молдавский ранний, Ранний — 83 и Ликурич проращивали в присутствии водного раствора экстракта

А.solani ВКМ F — 3236 Д в концентрации 50

0,1 g . Из 2000 семян каждого сорта отобрали по 20, корешки которых были наименее угнетены в росте. Полученные устойчивые проростки высадили в грунт. С растений собрали плоды, из которых выделили семена. 55

Образцы семян с каждого растения проращивали: а) в присутствии воды, б) в присутствии 0,1 $ раствора экстракта. Спустя 5 суток измерили длину корешков проростков, Образцы, у которых отношение б/а быпо наибольшим, послужили основой след ющего цикла отбора. По 2000 семян тех ру;,тений, семена которых были наиболее устойчивыми (отношение б/а наибольшим), проращивали в присутствии 0,1 ф водного раствора экстракта А.solani ВКМ F-3238 Д, По 2, наиболее устойчивых праростков вы - садили в грунт. Затем сравнили поражение отобранных растений альтернариазом по сравнению с растениями тех же сортов, нЕ прошедшими отбор (табл. 1).

Пример 2, Штамм BKM F — 3236 Д выращивали в поверхностной культуре на среде Чапека. В колбе Зрленмейера емкостью 300 мл наливали па 150 мл среды, автоклавировали 40 мин при 0,5 — 0,6 атм.избыточного давления, затем после охлаждения инокулировали мецилиальиыми дисками диаметром 10 мм. Диски вырезали у краев семи — десятисутачных колоний, выросших на агаризованной среде Чапека-Докса. Колбы с грибом оставили в покое при комнатных условиях на 70 суток, По оконча- нии инкубации отфильтровали культуральную жидкость и экстрагировали равным объемом хлороформа. После отгонки хлороформа на ротбрном испарителе получили экстракт штамма ВКМ F — 3236 Д, который использовали s селекции томатов на устойчивость к альтернариозу.

Цветки растений томатов сортов Молдавский ранний, Ранний — 83 и Ликурич кастрировали накануне раскрывания. На рыльца пестиков наносили каплю водного раствора экстракта А.solani ВКМ F — 3236 Д в концентрации 0,1 g,. Затем наносили пыльцу томатов тех же сортов. После опыления цветки закрывали ватными изолятора-ми. Из созревших плодов выделяли семена и подсчитывали их количества: а) в плодах, полученных при искусственном опылении с использованием экстракта штамма ВКМ F—

3236 Д; б) в плодах, полученных при искусственном опылении, где вместо экстракта на рыльца пестиков наносили каплю воды; в) в плодах, где опыление происходило естесственным путем, Из семян, собранных с. растений, для которых отношение а/б было наибольшим и приближенным к отношению а/б, вырастили томаты следующего поколения. Их цветки кастрировали и повторили перечисленные действия. В следующем поколении растений провели сравнение поражаемости альтернариозом тех томатов, которые подверглись пыльцевой селекции с применением штамма BKM F — 3236 Д, и сортообразцов исходных форм.

Результаты сравнения приведены в табл. 2.

1818041 8

Формула изобретения

Та бл и ца1

Полевая оценка поражаемости растений томатов альтернариозом (в баллах по пяти бальной шкале) П р и м е ч а н и е. Различие поражаемости не прошедших отбор и отобранных растений каждого сорта достоверны также при проверке по критерию Стьюдента (t = 0,05).

Таблица2

Полевая оценка поражаемости растений томатов альтернариозом (в баллах по пяти баль- ной шкале) П р и м е ч а н и е. Различия поражаемости не прошедших пыльцевую селекцию и отселектированных растений каждого сорта достоверны также и при проверке по критерию

Стюдента (t = 0,05).

Составитель О.Дараков

Техред М.Моргентал

Редактор

Корректор Q.Ãóñòè

Заказ 1910 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Из данных, представленных в табл. 1 и

2, видно, что использование. заявляемого штамма позволяет снизить поражаемость растений томатов альтернариозом и, таким образом, получить более устойчивые к забо- 5 леванию растения.

Штамм гриба Alternarta soling sorauer

ВКМ F — 3236 Д, используемый для селекции томатов на устойчивость к альтернариозу,