Способ получения бактериального препарата на основе bacillus subtilis

 

Использование: изобретение может быть использовано в микробиологической промышленности, сельском хозяйстве, пищевой промышленности и касается получения сухих бактериальных препаратов в споровой форме. Сущность изобретения: способ включает культивирование бактерий bacillus subtilis на поверхности полупроницаемой мембраны, расположенной на плотной питательной среде, до максимального накопления биомассы, а также перевод бактерий в споровую форму путем охлаждения клеток до температуры, не превышающей 10^oС, и выдерживания их при этой температуре не менее суток, последующее смешение спор бактерий с наполнителем. Перед смешением с наполнителем споры отделяют от полупроницаемой мембраны. В качестве наполнителя используют смесь сахара и крахмала при соотношении биомассы спор бактерий и крахмала не более 1:1 и биомассы спор бактерий и сахара не более 1:50. Способ позволяет повысить чистоту продукта и упростить технологию получения препарата. 4 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к технологии производства сухих бактериальных препаратов для сельского хозяйства, медицины и пищевой промышленности.

Известен способ получения бактериального препарата на основе штамма Bacillus subtilis c-3102 (заявка ЕПВ N 0287699, кл. C 12 N 1/20, опубл. 26.10.88). Способ включает суспензионное культивирование штамма бактерий в питательной среде, содержащей источник углерода, источник азота, неорганические вещества, витамины, аминокислоты, при pH 6 8 и температуре 35 40^oC в течение от 0,5 до 7 дней. Бактериальную культуру отделяют от питательной среды, промывают и концентрируют. Полученный продукт высушивают и смешивают с добавками-наполнителями для получения фармацевтических или ветеринарных препаратов.

Недостатком данного способа является сложность технологии получения препарата, т.к. способ включает операции по отмывке бактериальных клеток от компонентов питательной среды, а затем концентрирование бактерий центрифугированием. Препарат имеет малые сроки хранения, т.к. содержит живые бактерии в виде вегетативных палочек, которые не могут длительно сохранять свои биологически активные свойства.

Известен другой способ получения бактериального препарата на основе Bacillus subtilis (заявка Японии N 13-31171, кл. A 61 K 35/74, опубл. 02.05.91), включающий культивирование штамма бактерий на зерне или продукте его измельчения с последующими сушкой и дополнительным измельчением полученного продукта. Препарат используют в качестве кормовой добавки для домашних животных и птиц.

Недостатком данного способа является низкая чистота полученного препарата, вследствие чего он имеет узкую область применения (только как кормовая добавка для животных). Кроме того, препарат также имеет малые сроки хранения, т.к. содержит живые бактерии, которые не могут длительно сохранять свои биологически активные свойства.

Известен способ получения препарата для защиты растений от болезней (пат РФ N 2019966, кл. A 01 N 63/00, опубл. 1994), включающий суспензионное культивирование штамма бактерий Вас. subtilis ИПМ-215 до максимального накопления биомассы с последующим снижением концентрации основных компонентов питательной среды для перевода бактерий в споровую форму. Полученную культуральную жидкость со спорами бактерий подвергают сушке и смешивают с наполнителем. В качестве наполнителя используют диаммоний фосфат, поверхностно-активные вещества (ОП-7 или ОП-10) и сульфитно-дрожжевую бражку. Препарат имеет следующее соотношение компонентов, мас. сухой концентрат культуральной жидкости (титр спор не менее 40·10⁹ спор/г) 40 65, ПАВ 4 7, сульфитно-спиртовая бражка остальное.

Недостатком является низкая чистота получаемого препарата, т.к. он содержит компоненты среды культивирования, что ограничивает область его применения (только как средство защиты растений). Данная технология получения спор бактерий не позволяет получить высокий титр этих спор (не более 4· 10¹⁰ спор/г), т. е. клетки бактерий находятся в разных условиях в процессе спорообразования, в связи с чем часть бактерий гибнет, не успев образовать опоры. Кроме того, технология получения препарата сложна и имеет высокие энергозатраты, т.к. предусматривает сушку препаратов.

Известен способ получения бактериального препарата на основе Bacillus subtilis путем культивирования штамма бактерий Bacillus subtilis ВКМ В-1666 на плотной питательной среде с последующим отделением клеток от среды и лиофильным высушиванием их (авт. свид. СССР N 1708350, кл. A 61 K 35/66, 1992).

Данный способ имеет те же недостатки, что и вышеописанный.

Задачей предлагаемого изобретения является создание такого способа получения бактериального препарата на основе Bacillus subtilis, который обеспечивал бы повышение титра спор бактерий и чистоту препарата, а также упрощение технологии его получения.

Указанная задача решается тем, что в способе получения бактериального препарата, включающем культивирование бактерий Bac.subtilis на питательной среде до максимального накопления биомассы, перевод бактерий в споровую форму и последующее смешение их с наполнителем, согласно изобретению перед смешением с наполнителем споры бактерий Bac.subtilis отделяют от питательной среды, а в качестве наполнителя используют смесь сахара и крахмала при соотношении биомассы спор бактерий и крахмала не более 1:1 и биомассы спор бактерий и сахара не более 1:50.

При увеличении соотношения спор бактерий и крахмала более 1:1 не все споры будут иммобилизованы на крахмал, что снизит качество приготовляемого препарата.

При увеличении соотношения спор бактерий и сахара более 1:50 не обеспечиваются требуемые условия консервации спор бактерий и оптимальное перераспределение влаги в массе препарата, что снижает сроки его хранения.

Споры бактерий Bac.subtilis получают путем охлаждения биомассы до температуры, не превышающей 10^oC, и выдерживания при этой температуре не менее 1 сут.

В качестве питательной среды при культивировании бактерий используют плотный питательный агар, включающий пептоно-дрожжевой или мясопептонный экстракт. Причем поверхность питательной среды покрывают полупроницаемой мембраной с последующим нанесением на нее посевной дозы бактерий Bac.subtilis в концентрации, не превышающей 10⁸ кл./мл. Отделение наработанной биомассы бактерий в споровой форме от питательной среды осуществляют путем снятия биомассы бактерий с поверхности полупроницаемой мембраны с помощью стеклянного шпателя.

Для обеспечения иммобилизации бактериальных спор на частицах крахмала предварительно приготавливают смесь сахара и крахмала в соотношении 1:1, которую перемешивают с биомассой бактерий при соотношении биомассы и смеси указанных компонентов наполнителя не более 1:3 с последующим введением в полученную смесь остальной части сахара.

При предварительном смешении крахмала с сахаром в соотношении 1:1 снижается потребность в физиологическом растворе в несколько раз, т.е. процесс иммобилизации спор бактерий на частицы крахмала осуществляется при минимальном разбавлении смеси. При увеличении соотношения биомассы спор бактерий и смеси сахара с крахмалом более 1:3 не все споры бактерий могут быть иммобилизованы на частицах крахмала.

При получении препарата используют концентрат спор бактерий Bac.subtilis (после снятия с полупроницаемой мембраны) с титром не менее 3·10¹⁰ спор/г при следующем соотношении компонентов, мас.

Споры бактерий Bac.subtilis 0,1 1,0 Крахмал 1,0 3,0 Сахар Остальное Увеличение чистоты препарата обеспечивается за счет культивирования бактерий на поверхности полупроницаемой мембраны, вследствие чего компоненты питательной среды практически не смешиваются с биомассой бактерий и не загрязняют ее, а последняя представляет собой готовый концентрат, не требующий фильтрации или центрифугирования.

Высокий титр спор бактерий (до 10¹⁰ спор/г) обеспечивается за счет создания одинаковых условий спорообразования для каждой бактериальной клетки.

Иммобилизация спор бактерий на крахмале обеспечивает им дополнительную механическую защиту, предотвращает слипание спор бактерий и обеспечивает более равномерное их распределение в массе наполнителя.

Сахар является не только сорбентом-наполнителем, но и оказывает на препарат стабилизирующий и консервирующий эффект, создает более мягкие условия для хранения спор бактерий.

Кроме того, предлагаемый способ значительно упрощает технологию получения препарата как на этапах культивирования (в технологии отсутствует использование дорогих ферментеров, не требуются очистка и концентрирование препарата), так и на этапах получения готовой его формы (удаление или перераспределение влаги совмещено с получением готовой формы препарата).

Пример1.

Методика культивирования бактерий Bac. subtilis.

Для получения препарата используют штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-4759, обладающий антивирусной и антибактериальной активностью, способный наряду с подавлением патогенной и условно патогенной микрофлоры продуцировать α-2 интерферон человека и характеризующийся безвредностью для теплокровных.

Культивирование штамма бактерий осуществляют на плотной питательной среде следующего состава: Агар-агар 20 г/л Пептон 12 г/л Дрожжевой экстракт 5 г/л NaCl 5 г/л Вода До 1л Канамицин 50 мг/л
На 1 л агаризованной среды требуется 25 30 мл бактерий с титром около 10⁸ кл/мл. Питательную среду формируют в емкости в виде слоя, на который укладывают полупроницаемую мембрану, например целлофановую пленку. Сверху на пленку наносят посевную дозу штамма бактерий. Культивирование осуществляют в термостате при температуре 34 37^oC в течение 20 24 ч. Далее емкость переносят в термостат с температурой 6 10^oC и выдерживают при этой температуре в течение 1 сут. до образования спор бактерий. При указанном способе культивирования может быть получен титр спор 3х10¹⁰ спор/г. Споры бактерий снимают стеклянным шпателем с поверхности целлофановой пленки и собирают в стерильную емкость. Указанные споры бактерий представляют собой чистый концентрат биомассы, из которой приготавливают препарат.

Пример 2.

Методика культивирования штамма бактерий Bac. subtilis N 534, депонированного во Всесоюзной коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов под N 1666 D.

Культивирование штамма бактерий осуществляют на плотной питательной среде. Для этого 3%-ный стерильный мясопептонный агар объемом 250 мл размещают к емкость. На плотную питательную среду укладывают целлофановую пленку. Сверху на пленку наносят с соблюдением асептики 10 мл взвеси производственного штамма B. subtilis ВКМ N B-1666 D, содержащей по 10⁸ бактериальных клеток в 1 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида. Емкость помещают в термостат с температурой 36 37^oC. Через 24 ч с соблюдением асептики емкость с выросшей культурой переносят в термостат с температурой 7^oC и выдерживают при этой температуре в течение 1 сут. до образования спор бактерий. Споры бактерий снимают стеклянным шпателем с поверхности целлофановой пленки и чистую биомассу собирают в стеклянную емкость. При указанном способе культивирования может быть получен титр спор 3х10¹⁰ спор/г.

Пример 3.

Приготовление готовой формы препарата на основе Bac. subtilis ВКПМ В-4759.

Вначале приготавливают смесь сахара с крахмалом в соотношении 1:1. Далее к 5 ч. полученной смеси наполнителя добавляют 1 ч. биомассы спор бактерий и перемешивают.

При этом происходит иммобилизация спор бактерий на частицах крахмала. Далее в полученную смесь вводят сахар при соотношении биомассы спор бактерий и сахара 1:300. В результате получают готовый концентрированный препарат при следующем соотношении компонентов, мас.

Споры бактерий Bac. subtilis ВКПМ В-4759 с титром 3·10¹⁰ спор/г 0,33
Крахмал 0,82
Сахар Остальное до 100%
Остаточная влажность препарата составляет 2 5%
Пример 4.

Приготовление готовой формы препарата на основе Bac. subtilis ВКМ NB-1666 D.

Вначале приготавливают смесь сахара с крахмалом в соотношении 1:1. Далее к 3 ч. полученной смеси наполнителя добавляют 1 ч. биомассы спор бактерий и перемешивают. В полученную смесь добавляют физиологический раствор, объем которого равен объему биомассы бактерий, и интенсивно перемешивают. При этом происходит иммобилизация спор бактерий на частицах крахмала. Далее в полученную смесь вводят сахар при соотношении биомассы спор бактерий и сахара 1: 200. В результате получают готовый концентрированный препарат при следующем соотношении компонентов, мас.

Споры бактерий Bac. subtilis ВКМ NB-1666 D с титром 3,0х10¹⁰ спор/г - 0,49
Крахмал 0,74
Сахар Остальное до 100%
Остаточная влажность препарата составляет не более 5%
Пример 5.

Данные по хранению препаратов Bac.subtilis в концентрированной форме при температуре 24^oC приведены в табл.1.

Из табл. 1 следует, что в течение 12 месяцев хранения препаратов Bac.subtilis в споровой форме при температуре 24^oC их титр практически не изменился, что подтверждает высокую термостабильность препаратов в споровой форме, обеспечивающую значительное упрощение технологии их применения в сельском хозяйстве и медицине.

Пример 6.

Применение препаратов Bac. subtilis штаммов ВКПМ В-4759 и ВКМ В-1666.

Препарат на основе штамма Bac. subtilis ВКПМ NB-4759 обладает антивирусной и антибактериальной активностью и может быть использован для профилактики и лечения животных и человека. Кроме того, экспериментальные данные подтверждают возможность использования данного препарата как средства защиты плодов растений от фитофтороза.

Препарат на основе штамма Bac. subtilis 534 ВКМ NB-1666 используют для профилактики и лечения гнойно-воспалительных процессов различной локализации /гнойные раны, остеомиелит, сепсис, пневмония и др./, пищевой аллергии, дисбактериоза у теплокровных животных и человека.

При использовании препарата в виде концентрата, полученного предлагаемым способом /пример 3 и 4/, как профилактического и лечебного средства для человека его смешивают с пищевой добавкой, например глюкозой, сахаром в соотношении 1:100-1:200.

Концентрат препарата при использовании его как кормовой добавки для животных смешивают с наполнителем, например мукой или отрубями в соотношении 1: 200-1:300. Продукт повышает привес животных, улучшает эффективность использования кормов и предупреждает заболеваемость животных.

Средство защиты растений получают путем смешения концентрата с водой /перед применением/ или в сухом виде с торфом, мелом или золой в соотношении 1:200 -1:500.

Промышленная применимость. Изобретение может быть использовано в медицине, ветеринарии и в сельском хозяйстве как средство защиты растений.

Формула изобретения

1. Способ получения бактериального препарата на основе Bacillus subtilis, включающий засев и культивирование бактерий на питательной среде до максимального накопления бактериальных клеток с последующей их сушкой, отличающийся тем, что бактериальные клетки переводят в споровую форму, полученные споры отделяют от питательной среды, а сушке подвергают указанные споры путем смешения их с наполнителем, в качестве которого используют смесь сахара и крахмала при соотношении спор бактерий и крахмала не более 1 1 и спор бактерий и сахара не более 1 50.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что перевод бактерий Bac. subtilis в споровую форму осуществляют путем охлаждения клеток до температуры, не превышающей 10^oС, и выдерживания их при этой температуре не менее суток.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что засев бактерий Bac. subtilis в концентрации не превышающей 10⁸ кл. /мл, осуществляют на полупроницаемую мембрану, расположенную на питательной среде, а отделение спор бактерий осуществляют с поверхности указанной мембраны.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед смешиванием спор с наполнителем готовят смесь крахмала с сахаром в соотношении 1 1 с последующим введением туда спор бактерий, полученную смесь перемешивают и дополнительно вносят остальную часть сахара, получая при этом готовый препарат.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что при получении концентрата препарата используют споры бактерий Bac. subtilis с титром не менее 3 · 10¹⁰ спор/г при следующем соотношении компонентов, мас.

Споры бактерий Bac. subtilis 0,1 1,0
Крахмал 1,0 3,0
Сахар Остальное

РИСУНКИ

Рисунок 1