Способ выявления антигена вируса простого герпеса

 

Использование: изобретение относится к постмортальной диагностике герпетической инфекции. Цель изобретения - ускорение постановки этиологического диагноза. Сущность изобретения: для достижения поставленной цели материал фиксируют в 10%-ном нейтральном формалине, удаляют парафин ксилолом при 56-60°С, обрабатывают 15-20%-ным раствором сахарозы на буфере, используя для промывки на отдельных этапах выявления 1 %-ный бычий сывороточный альбумин на фосфатно-солевом буфере. Положительный эффект: способ позволяет достоверно выявлять антиген вируса простого герпеса.

союз сОВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 G 01 N 1/28

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 4861488/14 (22) 09.08,90 (46) 30.05.93, Бюл. N. 20 (71) Ленинградский научно-исследовательский институт детских инфекций (72) P.À.Hàñûðîâ и B.Ê.ÊàçàêîB (73) Научно-исследовательский институт детских инфекций (56) Айеого! оц(са! Scienses, 1984, 66, N. 1, р. 67-75. (54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИГЕНА ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА

Изобретение относится к медицине, а именно к постмортальной диагностике герпетической инфекции.

Цель изобретения — ускорение постановки этиологического диагноза, Для реализации этой цели исходили из того; что в работе прозектур, в качестве форсирующего раствора используется 10 — 30 ный раствор формалина, приготовленный путем разведения формальдегида обычной водой. Как показали наши исследования, для проведения иммунопероксидазной реакции возможно использование только забуференного 10 -ного формалина. При этом необходимо строго придерживаться определенного времени фиксации. Так, меньшая продолжительность фиксации приводит к диффузии. вымыванию антигена, а длительная — обуславливает маскировку антигена, образование большого числа альдегидных связей, препятствующих реак„„5U„„1819344 АЗ (57) Использование: изобретение относится к постмортальной диагностике герпетической инфекции. Цель изобретения — ускорение постановки этиологического диагноза.

Сущность изобретения: для достижения поставленной цели материал фиксируют в

107,-ном нейтральном формалине, удаляют парафин ксилолом при 56- 60 С, обрабатывают 15 — 20 -ным раствором сахарозы на буфере, используя для промывки на отдельных этапах выявления 1 -ный бычий сывороточный альбумин на фосфатно-солевом буфере. Положительный эффект: способ позволяет достоверно выявлять антиген вируса простого герпеса. ции антигенантитело. Для получения морфологической картины и воэможности выявления антигена ВПГ в ткани, исследуемый орган должен фиксироваться в 107-ном нейтральном формалине 30 ч, с последующей дофиксацией кусочков в этом же фиксаторе в течение 12 — 15 ч. Более длительная фиксация подавляет взаимодействие антиген-антитело, приводит к снижению концентрации выявляемого антигена.

Нами впервые также предложено депарафинирование срезов в 3 порциях ксилола при 56 — 60 С в течение 10 мин. Это обеспечивает полное удаление не только парафина, но и пластических веществ, образуемых в результате заливки в горячий парафин.

Общепринятое удаление парафина в ксилоле при комнатной температуре не обеспечивает очистки срезов от примесей, которые могут быть местом неспецифической реакции и значительно затрудняют интерпретацию полученных результатов.

1 819344

Впервые предложена обработка срезов

15-20 -ным раствором сахарозы, что способствует повышению проницаемости тканевых мембран. устранению "сшивок" между белками, образуемых в результате фиксации и заливки. Сахароза является индиферентным веществом, в отличие от фермента трипсина, используемого в этих же целях. После воздействия сахароэы, антиген становится более доступным для антител, что является необходимым условием для их взаимодействия. Уменьшение или повышение концентрации сахарозы от установленных величин не рекомендуется, поскольку в первом случае антиген остается недоступным для антител, а во втором— нарушается полнота выявления антигвна, Одна из сложных проблем, это наличие в сыворотке загрязненных антител. Очистка же сыворотки приводит к снижению ее 20 авидности, Значительное разведение специфической сыворотки, также нежелательно, т.к, удлиняет время проведения реакции, может снизится концентрация выявляемого антигена, Для устранения этих недостатков нами предложена обработка срезов 1 (бычьим сывороточным альбумином на фосфатно-солевом буфере в течение

30 мин, которое предшествует нанесению первой и второй сывороток, Используемый альбумин адсорбирует загрязняющие антитела, в значительной мере устраняется неспецифическое окрашивание.

Предложенный впервые комплекс методических приемов, выполняемых в процес- 35 се иммунопероксидазного выявления антигена вируса герпеса является обязательным. Невыполнение их не дает объективных результатов или искажает конечный результат исследований, не позволяет про- 40 вести соответствующую интерпрет-цию для постановки диагноза.

Описание способа: фиксция секционного материала в 107, нейтральном формалине в течение 1,5 сут с последующей 45 дофиксацией кусочка из исследуемого органа в этом же растворе в течение 12-15 ч; заливка в парафин; депарафиниров ие в 3 порциях ксилола при 56 — 60 С в гечение

10 мин; обработка срезов в 15-20 -ном 50 растворе сахарозы на фосфатно-солевой буфере рН 7,2 (на ночь); промывка в фосфатно-солевом буфере, рН 7,2 в течение 30 мин; обработка перекисью водорода (НтОг)

0,3 на воде в течение 30 мин; промывка 55 в 1 -ном растворе бычьего сывороточного альбумина 30 мин; нанесение на срез антигерпетической сыворотки 45 мин при 37 С.

Разведение сыворотки зависит от исходного титра антител; промывка в фосфатно-солевом буфере с 1 -ным бычьим сывороточным альбумином 30 мин; нанесение вторых антител, коньюгированных с пероксидазой в разведении 1:50 в течение 45 мин при комнатной температуре; отмыть препараты в буфере в трех порциях по 5 мин; обработка срезов в водном растворе, содержащем

0,05 3,3-диаминобензидинтетрахлориде и

0,025% Н О2 в течение 5 — 10 мин; докраска гематоксилином; заключение в бальзам.

Было проведено исследование головного мозга 26 умерших детей, у семерых из них (25 ) был выявлен антиген вируса герпеса, что позволило, с учетом данных клиники и характерных морфологических изменений поставить диагноз; герпетический менингоэнцефалит, Эти данные в 5 случаях были подтверждены результатами серологического исследования, Пример. Умерший ребенок Д., 4 мес, Клинический диагноз: гнойный менингоэнцефалит гемофильной этиологии. На вскрытии: мягкие мозговые оболочки резко отечны, базальная поверхность головного мозга и височные полюса покрыты студенистой массой.

При микроскопическом исследовании окрашенных срезов головного мозга выявлены распространенные очаги некроза, умеренная лимфоцитарная инфильтрация, большое количество клеток с резко гиперxpoMHblM ядром, В головном мозге, KBK и в легких и печени антиген вируса простого герпеса, Антиген вируса в клетках исследуемых органов был представлен гранулами коричневого цвета или их конгломератами с различной интенсивностью окраски, Результаты гистологического и иммунооксидазного исследования позволили сформулировать следующий диагноз: генерализованная герметическая инфекция, При этом результаты серологического исследования крови и ликвора на наличие противогерпетических антител были отрицательными, Лишь при выделении на культуре ткани, из мозга был выделен вирус, типирующийся как герпес, тип-1, Эти данные свидетельствуют о высокой достоверности используемого способа для выявления антигена вируса простого repneca, позволивший быстро установить этиологию заболевания.

Головной мозг и другие внутренние органы погружали в 10 -ный нейтральный формалин на 30 ч, после чего вырезанные кусочки органов дофиксировались в 10 ном нейтральном формалине в течение 12 ч; заливали в парафин; срезы освобождали от парафина в 3 порциях ксилола при 56 — 60 С в течение 10 мин; отмывали в дистиллированной воде 3 раза; обрабатывали срезы в

1819344

Составитель Д. Попов

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Е. Папп

Редактор

Заказ 1953 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101

15 -ном растворе сахарозы на фосфатносолевом буфере (ночь); после промывки в буфере обрабатывали 0,3 НгОг на дистиллированной воде (30 мин); наносили кроличью специфическую антигерпетическую сыворотку в разведении 1:10 и инкубировали при 37 С в течение 45 мин; после обработки на дистиллированной воде промывали в 1 -ном растворе бычьего сывороточного альбумина (БСА) на фасфатно-солевом растворе буфера (30 мин); многократно промывали в буфере, потом в буфере, содержащем 1 ; наносили антикроличью сыворотку, конъюгированную с пероксидазой в разведении 1:50, инкубировали в течение 45 мин при комнатной температуре; многократно смывали в буфере и погружали в водный раствор, содержащий

0,05 3 3-диаминобензидинтетрахлорида

0,025 Н202; срезы тщательно промывали в буфере, докрашивали гематоксилином и заключали в бальзам.

Проведено исследование архивного материала хранившегося в парафиновых блоках более 5 лет. Иммунопероксидазное исследование мозга 4 детей, погибших от герпетического менингоэнцефалита, выявило во всех случаях массивное скопление антигена вируса герпеса в различных отделах мозга. Таким образом, предложенный способ позволил ретроспективно изучить секционный материал и подтвердить в данном случае паталогоанатомический диагноз.

Значимость проведения подобных исследований велика, поскольку при возникшей необходимости возможно повторное исследо вание архивного материала.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет с большей достоверностью выя5 вить антиген вируса герпеса, установить его локализацию и характер распределения. что корригирует с результатами серологического и вирусологического исследований.

Метод достаточно прост, возможно его

10 широкое применение в патанатомической практике для постмортальной диагностики герпетической инфекции.

Предлагаемый способ имеет зкономическую значимость, т.к. при этом не требу15 ется отправка секционного материала в вирусологическую лабораторию для выделения вируса герпеса, что достаточно трудоемко и занимает большой промежуток времени, 20

Формула изобретения

Способ выявления антигена вируса простого герпеса путем фиксации исследуемого материала, приготовления срезов и

25 проведения иммунопероксидазной реакции, отличающийся тем, что, с целью ускорения способа, исследуемый материал фиксируют в 10 -ном нейтральном формалине в течение 36 — 48 ч, трижды депарафи30 нируют срезы в ксилоле при 56-60 С в течение 10 мин, затем обрабатывают срезы в 15 — 20 -ном растворе сахарозы на фосфатно-солевом буфере и промывают в фосфатно-солевом буфере, содержащем 1

35 бычьего сывороточного альбумина.