Способ получения белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам

 

(я) А 23 J 1/00, 3/20

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5014053/13 (22) 31,10.91 (46) 07.09.93, Бюл. М 33 — 36 (71) Всесоюзная ассоциация "Фармбиопресс" (72) Наймытенко Е,П., Быков B.A., Крашенинников О.А., Наймытенко К.Е. (73) Крашенинников О.А.

I (56) Эндорфины./Под ред. Э.Коста, М.Трабуки, М.: Мир, 1981.

Хухо Ф, Нейрохимия. Основы и принципы. М.: Мир, 1990.

Бахарев В.Д. Клиническая нейрофизиология регуляторных пептидов. Свердловск:

Издательство Уральского университета, 1989.

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения белков растительного происхождения, обладающих биологической активностью.

Получаемые предлагаемым способом белковые препараты могут быть использованы в медико-биологических исследованиях и являются потенциальными лекарственными средствами.

Фундаментальными исследованиями заявителя было установлено, что кислоторастворимая фракция белков, выделенная иэ различного растительного сырья, обладает сродством к опивтным клеточным рецепторам и при введении в живой организм они вызывают эффеK Thl. аналогичные эффектам

„„Я0„„2000061 С (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВ, ОБЛАДАЮЩИХ СРОДСТВОМ К ОПИАТНЫМ РЕЦЕПТОРАМ (57) Использование; в области биотехнологии при получении белков растительного происхождения, обладающих биологической активностью. Сущность изобретения: получают кислоторастворимую фракцию белков путем экстрагирования растительного сырья подкисленной водой или подкисленными органическими растворителями с последующим ее осаждением органическими растворителями. В качестве растительного сырья используют ягоды, траву омелы белой, капустную культуру корня родиолы розовой.

Для подкисления используют соляную кислоту. Фракцию кислоторастворимых белков сушат, перед сушкой или после сушки ее подвергают стерилизации. 5 э.п. ф-лы. природных опиоидов — анальгезирующий, снотворный, психотропный.

Сущность предложенного способа состоит в том, что после гомогениэации растительного сырья и экстракции балластных веществ водно-спиртовым раствором, ацетатным буфером из него извлекают кислоторастворимую фракцию белков и освобождают ее от посторонних примесей, Исходным .сырьем для получения продукта может служить различное растительное сырье, но предпочтительно испольэовать ягоды и траву омелы белой, калусную культуру корня родиолы розовой, кормовые дрожжи — пап рин, корневища элеутерококка колючего.

2000061

Кислоторастворимую фракцию растительных белков можно извлекать любыми известными приемами, но наиболее рационально ее экстрагировать подкисленной водой или подкисленными органическими растворителями.

Степень кислотности экстракта не имеет решающего значения и обычно составляет 0,25 — 1,0 н. Природа: кислоты также не оказывает особого влияния на эффективность процесса, однако использование соляной кислоты представляется наиболее удачным, Для освобождения кислоторастооримой фракции от остатков растительных клеток взвесь растительной массы в растворах соляной кислоты или подкисленного этанола подвергают центрифугированию, надосадочную жидкость фильтруют. Могут, применяться и иные методы дополнительной очистки.

Из кислотного экстракта белки могут быть осаждены органическими растворителями, Осажденные кислоторастворимые белки могут быть повторно растооримы о растворах кислот, подвергнуты дополнительному центрифугирооанию и осаждению.

Фракцию освобожденных от примесей кислоторастооримых белков для удобства работы можно высушить. например, путем лиофипизации. Поскольку целевой продукт используется для пэрэнтерального введения после или до высушивания возможен этап его стерилизации (фильтрование через стерилизующие фильтры, стерилизующая обработка продукта электронами высоких энергий).

Остаточная влажность высушенного продукта составляет 3 — 5, препарат полностью растворяется в воде.

Полученный препарат дает все характерные реакции на белки. Его мол м. Составляет от 1,5 кДа до 80 кДа.

При дискэлектрофореэе в полиакрилэмидном геле установлено наличие нескольких индивидуальных белков.

Характер наблюдений биологической активности полученного препарата обусловлен, по-видимому, суммарным присутствием индивидуальных белков. Для корректировки биологических эффектов допустимо фракционирование целевого продукта.

Сродство полученных предложенным способом белков к опиатным рецепторам было доказано классическим напокспновым методом и методом конкурентного в реакции образования комплекса 3Н-наIIoKcoH-рецептор синаптическ х мг мбпэн

55 головного мозга мышей в прису г . г оии киспоторасгворимых белков (1, 2).

Теоретически и практически доказано, что биологический эффект природных соединений опиоидной природы возникает в результате их связывания с опиатными рецепторами нескольких типов.

Известно также, что антагонист опиоидных соединений налоксон имеет большое сродство к опиатным рецепторам и поэтому вытесняет опиоидные соединения с их поверхности, тем самым "отмечяя" биологические эффекты, обусловленные опиоидами.

Многочисленными экспериментами показано, что полученные предложенным способом белки при введении в организм экспериментального жиоотного вызывают клиническую картину, соответствующую последствиям введения природных опиоидов.

Последующее введение напоксона полностью устраняет эффекты биологически активных белков.

Классическая реакция экспериментальных животных нэ налоксон и общая клиническая картина воздействия белков, полученных предложенным способом, однозначно подтверждают специфическое взаимодействие этих белков с опиатными рецепторами, Анализ патентной и научно-технической литературы показал, что сведений об оригинальной способности киспоторастворимых растительных белков связываться с опиатными клеточными рецепторами не имеется.

Зэявитепем впервые установлена способнос? ь нового класса соединений— белков — связываться с опиатными рецепторами и вызывать биологические эффекты, воспроизводящие эффекты природных опиоидов.

Установленная заявителем закономерность априорно не вытекает из известного уровня знаний.

До настоящего времени бып известен лишь один класс соединений — низшие пептиды, которые связывались с опиатными рецепторами. Наиболее известны и доступны нейропептиды — энкефапины и эндорфины, дающие эффекты, сходные с эффектами опиоидов (1. 2, 3).

Способы получения этих нейропептидов сложны, э их эффект ог?здействия кратковременен.

Предлагаемый способ получения белков, обладающих сродством к опиэтным рецепторам, несравненно проще способа получения энкефэпинов и зндорфинов, э подученные препппженглым г пг?сг бг?м белки

2000061 вызывают более разносторонний и более длительный эффект.

Разработанный спЬсоб открывает по крайней мере путь решения одной из наиболее актуальных проблем — безопасного длительного обезболивания.

Более подробно сущность предложенного способа поясняется следующими примерами, Пример 1. Свежие ягоды омелы белой (1 кг) взвешивают в 3 л 0,5 н. раствора соляной кислоты, гомогенизируют при 15 тыс. оборотов ножа гомогенизатора в 1 мин

30 мин (6 циклов длительностью 5 мин в интервале 10 мин). Экстрагируют 48 ч при комнатной температуре при периодическом перемешивании (80 — 110 оборотов мешалки в 1 мин).

После этапа экстракции взвесь центрифугируют в течение 60 мин при 5 тыс.об/мин.

Надосадочную жидкость декантируют, осадок отбрасывают. Кислотный экстракт вновь центрифугируют 45 мин при 15 тыс.об/мин.

Надосадочную жидкость декантируют.

Осадок отбрасывают, К надосадочной жидкости постепенно приливают 12 объемов охлажденного ацетона, энергично перемешивают и оставляют на 18 ч для отстоя взвеси.

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре, дважды промывают холодным ацетоном, снимают с фильтра, переносят в стеклянный сосуд, В сосуд вносят 1 л 0,1 М раствора лимонной кислоты и периодически перемешивают. После набухания белков сосуд помещают в водяную баню, постепенно нагревают до 45 С и выдерживают 30 мин, . После растворения белков раствор центрифугируют 60 мин при 5 Tblc.oá/ìèí. Надосадочную жидкость декантируют, Осадок отбрасывают. К надосадочной жидкости постепенно приливают 12 объемов ацетона, энергично перемешивают и оставляют на 18 ч для отстоя взвеси, Осадок собирают на двойном бумажном фильтре. дважды промывают холодным ацетоном, снимают с фильтра, переносят в кристаллизатор и помещают в вакуумный сушильный шкаф. Сушку осуществляют при температуре 37 — 38 С в течение 4 ч.

Полученный сухой препарат измельчают до порошкпобразного состояния и готовят его 2 -ный раствор в 0,1 М растворе лимонной кислоты. Для этого навеску продукта вносят в раствор кислоты и периодически перемешивают. После набухания белков, что наблюдается через 2 ч, сосуд помещают в вод нун баню, постепенно нагревают до 4 . Т и выдерживают 30 мин.

5

После растворения белков и просветления раствора его центрифугируют в течение 40 мин при 5 тыс. об/мин.

Надосадочную жидкость подвергают осветляющей, а затем и стерилизующей фильтрации через пластинчатые фильтры.

Раствор разливают по 3 мл э стерильныв стеклянные ампулы по 10мл, замораживают на протяжении 24 ч до температуры — 50"С и подвергают сублимационному высушиванию в течение 72 ч при начальной температуре — 35"С до конечной температуры 25 С.

Ампулы заполняют азотом и эапаивают.

Каждая ампула содержит 60 мг целевого продукта, а всего было получено 2,4 г препарата.

В качестве экспериментальных животных испольэовали кроликов и кошек.

Кроликам препарат вводили в ушную вену в дозе 5 мг/кг, Через 5 мин после введения препарата у всех животных (3 кролика) наступили кататонический ступор и глубокая анальгезия в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов.

Анальгезия тканей ушных раковин была очень глубокой, Животные не реагировали на действие термического фактора, даже при обугливании тканей.

После развития эффекта (через 60 мин) двум кроликам подкожно в дозе 4 мг/кг был введен налоксон.

Через 5 мин наблюдалось восстановление двигательной активности животных и болевой чувствительности.

Изменения поведения кролика, не получавшего налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч.

Кошкам препарат вводили в вену бедра в дозе 10мг/кг. Через 7 мин у всех животных (5 кошек) наступили кататонический ступор, сонливость. Через 15 мин наступила глубокая анальгезия в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов, исчезли чувство страха и агрессивность, После полного развития эффекта (через 60 мин) двум кошкам подкожно в дозе

4 мг/кг был введен налоксон.

Через 5 мин наблюдалось восстановление болевой чувствительности, страха и агрессивности.

Изменения поведения кошек, не получавших налоксон, не отмечалось на протяжений более 6 ч, Пример 2. Сухую калусную культуру клеток корня родиолы розовой измельчают до oopoUjK006p83Horo состояния. Нзвеску исходного сырья массой 2 кг взвешивают в

10 л 40 (-ного водно-спиртового рл<..>вора и

2000061 зкстрагйруют при комнатной температуре

96 ч.

После этапа экстракции взвесь центрифугируют в течение 60 минут при 5 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость декантируют, отстаивают 48 ч, проводят осветляющую фильтрацию, используют как готовую лекарственную форму.

Осадок взвешивают в 10 л 0,2 М ацетатуксусного буфера 0.14 М по хлориду натрия (рН 4,8).

Взвесь хорошо перемешивают и подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц, Проводят 3 цикла обработки ультразвуком по 30 мин. Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч, После этапа экстракции взвесь центрифугируют в течение 60 мин при 5 тыс.об/мин.

Надосадочную жидкость отбрасывают. Осадок после промывания дистиллированной водой на центрифуге взвешивают Ъ 10 л

0,5 н. раствора соляной кислоты. Взвесь после перемешивания подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц. Проводят 2 цикла обработки ультразвуком по

30 мин.

Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч. После экстракции взвесь центрифугируют

60 мин при 5 тыс.об/мин, Надосадочную жидкость декантируют, Отстаивают 24 ч, подвергают осветляющей фильтрации.

К осветленному фильтрату постепенно приливают 10 объемов охлажденного ацетона и оставляют на 18 ч для отстоя взвеси.

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре. дважды промывают холодным ацетоном, снимают с фильтра, переносят в кристаллизатор и помещают в вакуумный сушильный шкаф, Сушку осуществляют при температуре

37 — 38 С в течение 4 ч. Полученный сухой препарат измельчают до порошкообразного состояния и готовят его 27ь-ный раствор в 0,1 М растворе лимонной кислоты.

Для этого навеску продукта вносят в раствор кислоты и периодически перемешивают. После набухания белков, что наблюдалось через 2 ч, сосуд помещают в водяную баню, постепенно нагревают до 45 С и выдерживают 50 мин до просветления жидкости.

После растворения белков и просветления раствора его центрифугируют в течение

40 мин при 5 тыс.об/мин. Надосадочную жидкость подвергают осветляющей, а затем и стерилизующей фильтрации через пластинчатые фильтры.

Раствор разливают по 3 мл в стерильные стеклянные ампулы по 10 мл, эамораживают на протяжении 24 ч до температуры

-50 С и подвергают сублимационному высушиванию в течение 72 ч при начальной температуре -35 С до конечной температуры

25 С.

Ампулы заполняют азотом и запаивают.

Каждая ампула содержит 60 мг целевого продукта, а всего было получено 28,5 г препарата.

В качестве экспериментальных животных использовали кошек. Кошкам препарат вводили в вену бедра в дозе 15 мг/кг.

Через 10 мин у всех. животных- (10 кошек) наступили кататонический ступор, сонливость и эйфория, Через 30 мин наступила глубокая анальгеэия в области черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов.

После полного развития эффекта (через

60 мин) трем кошкам подкожно введен налоксон в дозе 4 Mr/êã, Через 5-7 мин у них восстановилась болевая чувствительность, прерваный сон и эйфория.

Изменения поведения кошек, не получавших налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч.

П р.и м е р 3. Сухое корневище элеутерококка колючего измельчают до орошкообразного состояния. Навеску исходного сырья массой 1 кг взвешивают в 5 л 0,2 М ацетат-уксусного буфера 0.14 М по хлориду натрия (р Н 4,8), Взвесь хорошо перемешивают и подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц, Проводят 3 цикла обработки ультразвуком по 30 мин, Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч, После этапа экстракции взвесь центрифугируют в течение 60 мин при 5 тыс.об/мин.

Надосадочную жидкость отбрасывают.

Осадок после промывания дистиллированной водой на центрифуге взвешивают в 5 л

0,25 н, раствора соляной кислоты, Взвесь перемешивают и подвергают ультразвуковой обработке при частоте

25 кГц, Проводят 2 цикла обработки ультразвуком по 30 мин, Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании 48 ч, После этапа экстракции взвесь центрифугируют в течение 60 мин при 5 тыс.об/мин. надосадочную жидкость подвергают отстою

24 ч и осветляющей фильтрации. Осадок отбрасывают.

К осветленному фильтрату постепенно приливают 12 объемов охлажденного ацетона и оставляют на 18 пля отстоя яэяеси. 000061

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре. дважды промывак1т холодным ацетоном, снимают с фильтра, переносят в стеклянный сосуд. В сосуд вносят 2,5 л 0,1

М раствора лимонной кислоты и периодически перемешивают. После набухания белков сосуд помещают в водяную баню, постепенно нагревают до 45"С и выдерживают 30 мин.

После растворения белков раствор центрифугируют 60 мин. при 5 тыс.об/мин. К надосадочной жидкости постепенно приливают 12 объемов ацетона, энергично перемешивают и oclавляют на 18 4 дпя отстоя взвеси.

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре, дважды промывают холодным ацетоном, снимают с фильтра, переносят в кристаллизатор и помещают в вакуумный сушильный шкаф.

Сушку осуществляют при температуре

37 — 38 С в течение 4 ч.

Полученный сухой препарат измельчают до порошкообраэного состояния и готовят его 2; -ный раствор в 0,1 М растворе лимонной кислоты, Для этого навеску продукта вносят в раствор кислоты и периодически перемешивают.

После набухания белков, что наблюдается через 2 ч, сосуд помещают в водяную баню, постепенно нагревают до 45 С и выдерживают 30 мин.

После растворения белков и просветления раствора его центрифугируют в течение

40 мин при 5 тыс.об/мин.

Надосадочную жидкость подвергают осветляющей, а затем и стерилизующей фильтрации через пластинчатые фильтры, Раствор разливают по 3 мл в стерйльные стеклянные ампулы Ilo 10 мл, эамораживают на протяжении 24 ч до температуры

-50 С и подвергают сублимационному высушиванию в течение 72 ч при начальной температуре -35 С до конечной температуры

25 С.

Ампулы заполняют азотом и запаивают.

Каждая ампула содержит 60 мг целевого продукта, а всего было получено 10,8 г препарата, В качестве экспериментальных животных использовали кошек.

Кошкам препарат вводили в вену бедра в дозе 15 мг/кг и подкожно в дозе 20 мг/кг.

Через 5 мин у всех животных (6 кошек), которым препарат был введен внутривенно, а через 15 мин у особей (6 кошек), которым было сделано подкожное введение, наступили кататоническии ступор. сонливость.

Через 30 мин наступили глубокая анальге5

1О

55 зия в эОне leperlHo моэговыx ut спинно. моз. говых нервов и глубокий сон.

Посл . полного развития эффекта (через

60 мин) четырем кошкам (по две кошки из каждои груг1пы) в дозе 4 мг/кг бы 1 введен налоксон, Через 3--5 мин наблюдалось восстановление двигательной активности. болевой чувств.лтел. ности, бып прерван сон, Изменения ",оведен;1 кошек. не получавших налоксон, не о1мс ало. ь на npoTslжении более " ч.

Пример 4. Навеску кормовых дрожжей-паприн в когчлчес e 2 Kl взвешивают в

5 и 0 2 M ацегат-уксусного буфера г ..14 K/1 по хлориду, 1э1рия (рН 1,8).

Взвесь хорошо пере мешивают v, подвергаю ультразвуковой обработ <е ори частоте 25 кГц, Проводят 3 цикла обработки ультраз;1уком по 30 лин. экстрагируют при комнатной температуре 24 ь

После этапа экстракции взвесь центрифуги руют в течение 60 мин при 5 тыс.об/мин.

Надосадочную жидкость отбрасывают. Осадок после промывания дистиллированной водои на центрифуге Развешивают в 5 л 0,25 н раствора соляной кислоты.

Взвесь перемешивают, подвергают ультразвуковой обработке при частоте 25 кГц.

Проводят 2 цикла обработки ультразвуком по 30 мин.

Экстрагируют при комнатной температуре при периодическом перемешивании

48 ч. После экстракции взвесь центрифугируют в течение 60 ллии при 5 тыс.об/мин, Надосадочную жидкость декан,ируют, оставляют на 24 ч для отстоя, вновь центрифугируют 45 мин при 5 тыс,об/мин, надосадочную жидкость фильтруют через двойной бумажный фильтр.

К фильтрату постепенно приливают 10 объемов охлажденного ацетона, энергично перемешивают и оставляют на 18 ч для отстоя взвеси.

Осадок собирают на двойном бумажном фильтре, дважды промывают холодным ацетоном, снимают с фильтра, переносят в кристаллизатор и помещают в вакуумный сушильный шкаф. Сушку осуществляют при температуре 37 — 38" С в течение 4 ч.

Сухой продукт измельчают до порошкообразного состояния и готовят его 5 (,-ный раствор в 0,1 M растворе лимонной кислоты.

Дпя этого навеску препарата вносят в раствор кислоты и периодически перемешивают. После набухания белков сосуд помещают в водяную баню, постепенно нагревают до 45 С и выдерживают 30 мин..

После растворения белков и просРетления

РаСтВОРа его ЦЕНтРИфУГИРуЮт В ТЕЧЕНИЕ

40 мин при 5 тыс,об/мин.

2000061

Составитель Е. Наймытенко

Техред М.Моргентал

Корректор А. КозоРиз

Тираж

Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Редактор Л. Павлова

Заказ 3052

Произнодсгвеннп-издательский комбинат "Патент". г, Ужгород, ул.Гаафари л, 101

Надосадочную жидкость подвергают осветляющей, а затем и стерилизующей фильтрации через пластинчатые фильтры.

Раствор разливают по 3 мл в стерильные стеклянные ампулы по 10 мл, замораживают на протяжении 24 ч до температуры

-50ОС и подвергают сублимационному высушиванию в течение 72 ч при начальной температуре -35 С до конечной температуры

Z5 C.

Ампулы заполняют азотом и запаивают, Каждая ампула содержит 150 мг целевого продукта, а всего было получено 21,5 г препарата.

В качестве экспериментальных животных использовали кроликов, кошек, павианов-гамадрилов.

Кроликам препарат вводили в ушную вену в дозе 15 мг/кг.Через 10 мин после введения препарата у всех животных (3 кролика) наступили кататонический ступор и глубокая анальгезия в области черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов.

Животные не реагировали на сильный термический фактор даже при обугливании тканей ушных раковин.

После развития эффекта (через 60 мин) одному кролику подкожHo в дозе 4 мг/кг был введен налоксон.

Через 4 мин наблюдалось восстановление двигательной активности и болевой чувствительности, Изменения поведения кроликов, не получавших налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч.

Кошкам препарат вводили в вену бедра в дозе 20 мг/кг. Через 5 мин у всех животных (5 кошек) развивались кататонический ступор, сонливость, Через 15 мин наступили глубокая анальгезия в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов, глубокий сон.

После полного развития эффекта (через 60 мин) двум кошкам подкожно в дозе

5 мг/кг был введен налоксон.

Через 3 мин наблюдалось восстановление болевой чуствительности, был прерван сон.

Изменения поведения кошек, не получавших налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч

Павианам-гамадрилам препарат вводили в вену предплечья в дозе 20 мг/кг .

В течение первых 30 мин после введения у всех животных (3 павиана) наступили

5 тремор мышц, сонливость, исчезли чувство страха и агрессивность, Развивались глубокая анальгезия в зоне черепно-мозговых и спинно-мозговых нервов, эйфория.

После полного развития эффекта (через

10 60 мин) одному павиану-гамадрилу подкожно в дозе 5 мг/кг был введен налоксон.

Через 6 мин наблюдалось восстановление болевой чувствительности, появление чувства страха и агрессивности.

15 Изменения поведения павианов-гамадрилов, не получавших налоксон, не отмечалось на протяжении более 6 ч.

Формула изобретения

20 1. Способ получения белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам, отличающийся тем, что в качестве белков, обладающих сродством к опиатным рецепторам, используют фракцию кислото25 растворимых растительных белков растительного сырья с мол.мас.1,5 — 80 кД.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качеСтве растительного сырья используют ягоды, траву омелы белой, калуст30 ную культуру корня радиолы розовой.

3 Способ по п.1, отличающийся тем, что фракцию растворимых белков получают экстрагированием растительного сырья подкисленной водой или подкислен35 ными органическими растворителями с последующим осаждением ее органическими растворителями.

4. Способ по пп,1 — 3, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что для подкисления воды или орга40 нического растворителя используют соляную кислоту.

5. Способ поп1,отл ичающийся тем, что фракцию кислоторастворимых белков подвергают сушке.

45 6.Способпопп.1и7,отличающийс я тем, что перед сушкой или после сушки фракцию кислоторастворимых белков подвергают стерилизации.