Способ количественного определения гаптенов

 

Использование: биотехнология, иммунология, функциональная диагностика. Сущность изобретения: количественное определение гаптенов с помощью конкурентного иммуноферментного анализа в акустической камере и регистрации изменения начальной скорости распространения акустических колебаний в реакционной среде. Нижний предел обнаружения гаптенов составляет 5×10^-8M.

Изобретение относится к иммунологии и может найти применение в биотехнологии и медицине при количественном определении гаптенов.

Известен способ количественного определения антигенов или гаптенов с помощью пьезоэлектрического датчика. Способ включает иммобилизацию соответствующих антител на поверхности пьезоэлектрического кристалла, инкубацию иммобилизованных антител с раствором исследуемого антигена или гаптена, возбуждение резонансной частоты в пьезоэлектрическом иммуносенсоре и регистрацию изменений данной резонансной частоты.

Недостатком этого способа является низкая точность анализа, обусловленная неопределенностью процесса иммобилизации антител на поверхности пьезоэлектрического кристалла. Другим недостатком способа является низкая чувствительность, в частности, для IgG нижний предел обнаружения составляет 1,5 ˙ 10^-7 М.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ количественного определения гаптенов путем проведения конкурентного связывания антигаптеновых антител с исследуемым образцом и конъюгатом белок-гаптен в акустической камере и регистрации скорости распространения акустических колебаний в реакционной среде.

Недостатком известного способа является низкая точность и длительность анализа, за счет использования второй стадии реакции антиген-антитело, в ходе которой образуется нерастворимый преципитат. Эта стадия иммунохимической реакции не подчиняется строгой стехиометрии и на несколько порядков медленнее первой стадии, в ходе которой образуется только бимолекулярный комплекс антиген-антитело. Другим недостатком известного способа является низкая чувствительность определения гаптенов. Нижний предел обнаружения гаптенов составляет 5 ˙ 10^-8 М.

Целью предложенного способа является повышение чувствительности и точности анализа.

Цель достигается тем, что в известном способе количественного определения гаптенов путем проведения конкурентного связывания антигаптеновых антител с исследуемым образцом и конъюгатом белок-гаптен в акустической камере и регистрации скорости распространения акустических колебаний в реакционной среде, согласно изобретению в качестве конъюгата белок-гаптен используют конъюгат фермент-гаптен, который подвергают предварительной инкубации с антителами к гаптену, в акустическую камеру дополнительно вводят соответствующий субстрат фермента, а количество гаптена определяют по изменению начальной скорости распространения акустических колебаний в реакционной среде.

Сравнительный анализ заявляемого решения с прототипом показывает, что он отличается от известного тем, что конкурентное связывание антигаптеновых антител с гаптеном проводят в присутствии конъюгата фермент-гаптен и соответствующего субстрата этого фермента, что позволяет определять количество гаптена по изменению начальной скорости распространения акустических колебаний в реакционной среде и тем самым работать с компонентами иммунохимической реакции в концентрациях на несколько порядков меньших, чем требуется для образования и акустического проявления стадии преципитации, необходимой для осуществления способа-прототипа.

Определение количества гаптена в исследуемой среде проводят по калибровочной кривой, которую получают следующим образом. Раствор антигаптеновых антител заданной концентрации инкубируют несколько минут с конъюгатом фермент-гаптен. В две идентичные акустические камеры вносят раствор субстрата. Затем в одну из камер, выбранную в качестве рабочей, вносят исследуемую пробу. В другую камеру, выбранную в качестве опорной, вносят буферный раствор. После этого в обе камеры вносят смесь конъюгата фермент-гаптен с антигаптеновыми антителами, перемешивают, возбуждают в камере с исследуемой смесью стоячую акустическую волну, регистрируют скорость акустических колебаний в реакционной среде сразу после смешивания и через определенное время (длительность которого зависит от активности фермента) определяют разность полученных значений. Операции повторяют при использовании различных концентраций гаптена и строят калибровочную кривую.

П р и м е р 1. Для построения калибровочной кривой определения тестостерона смешивают раствор антител к тестостерону (концентрация IgG 50 мкг/мл) с конъюгатом α-амилаза - тестостерон в концентрации 0,5 мкг/мл и инкубируют 3 мин при 37^оС в 0,01 М фосфатном буфере, рН 7,4. В две идентичные акустические камеры вносят по 0,4 мл 1% раствора крахмала в 0,5 М фосфатном буфере, рН 6,5. Затем в одну из камер, выбранную в качестве рабочей, вносят 0,4 мл исследуемой пробы с тестостероном. В другую камеру, выбранную в качестве опорной, вносят 0,4 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 6,5. После этого в обе камеры вносят по 0,06 мл смеси конъюгата α -амилаза-тестостерон с антительной сывороткой к тестостерону и перемешивают магнитной мешалкой при 37^оС. В камерах создают стоячую волну и регистрируют изменения собственной частоты резонатора в области 7,4 МГц. Учитывая, что изменения собственной частоты резонатора линейно связаны с изменениями скорости распространения акустических колебаний в исследуемой среде, рассчитывают разность скоростей акустических колебаний между первой и восьмой минутами реакции (ΔU₈).

Операции повторяют при использовании различных концентраций тестостерона в диапазоне 4 ˙ 10^-10-1,3 ˙ 10^-8 М и строят калибровочную кривую.

Результаты представлены в табл. 1.

Неизвестную концентрацию тестостерона определяют, повторив процедуру с исследуемой пробой и далее сравнением результата с калибровочной кривой.

Как видно из таблицы, предел обнаружения тестостерона за восемь минут ферментативной реакции составляет 4 ˙ 10^-10 М, а погрешность измерения контрольной пробы 1,8% .

П р и м е р 2. Для построения калибровочной кривой определения эстрадиола смешивают антитела к эстрадиолу (концентрация IgG 100 мкг/мл) с конъюгатом α -амилаза - эстрадиол в концентрации 1 мкг/мл и инкубируют 3 минуты при 37^оС в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,4. В две идентичные акустические камеры вносят по 0,4 мл 1% раствора крахмала в 0,5 М фосфатном буфере, рН 6,5. Затем в одну из камер, выбранную в качестве рабочей, вносят 0,2 мл исследуемой пробы с эстрадиолом. В другую камеру, выбранную в качестве опорной, вносят 0,2 мл 0,05 М фосфатного буфера, рН 6,5. После этого в обе камеры вносят по 0,06 мл смеси коньюгата α -амилаза-эстрадиол с антительной сывороткой к эстрадиолу и перемешивают магнитной мешалкой при 37^оС. В камерах создают стоячую волну и регистрируют изменения собственной частоты резонатора в области 7,4 МГц. Учитывая, что изменения собственной частоты резонатора линейно связаны с изменениями скорости распространения акустических колебаний в исследуемой среде, рассчитывают разность скоростей акустических колебаний между первой и восьмой минутами реакции ( ΔU₈).

Операции повторяют при использовании различных концентраций эстрадиола в диапазоне 8 ˙ 10^-10-3,8 ˙ 10^-8 М и строят калибровочную кривую.

Результаты представлены в табл. 2.

Неизвестную концентрацию эстрадиола определяют, повторив процедуру с исследуемой пробой и далее сравнением результата с калибровочной кривой.

Как видно из таблицы предел обнаружения эстрадиола за восемь мин ферментативной реакции составляет 8 ˙ 10^-10 М, а погрешность измерения контрольной пробы 1,6% .

Как видно из выше приведенных примеров предлагаемый способ позволяет повысить чувствительность измерений с 5 ˙ 10^-8 М до (4-8) ˙ 10^-10, т. е. примерно на два порядка, а точность измерений в 2-3 раза. (56) Авторское свидетельство СССР N 960627, кл. G 01 N 33/48, 1982.

Формула изобретения

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГАПТЕНОВ путем конкурентного связывания антигаптеновых антител с исследуемым образцом и конъюгатом белок - гаптен в акустической камере и регистрации скорости распространения акустических колебаний в реакционной среде с последующим учетом результатов, отличающийся тем, что в качестве конъюгата белок - гаптен используют конъюгат фермент - гаптен, предварительно инкубированный с антигаптеновыми антителами, в акустическую камеру дополнительно вводят субстрат фермента, а результат учитывают по изменению начальной скорости распространения акустических колебаний в реакционной среде.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2