Способ оценки степени адгезии грибов рода candida на эпителиоцитах

 

Использование: медицинская микробиология. Сущность изобретения: способ включает проведение адгезивной реакции между эпителиоцитами и микроорганизмами, подсчет адгезивных микроорганизмов в пересчете на один эптелиоцит. Затем используют дополнительное дифференциальное центрифугирование эптелиоцитов после реакции через градиент плотности фиколл-верографин, для выявления количества прочно- и слабоадгезированных микроорганизмов на клетке и вновь подсчитывают оставшиеся микроорганизмы. При оценке адгезии грибов рода Candida проводят центрифугирование эпителиоцитов после инкубации через градиент фиколл-верографин с плотностью 1,077 в течение 10 - 20 мин при g 30 - 50. Процентное содержание прочноадгезированных микроорганизмов подсчитывают по формуле K₁=X₂/X₁·100% , а слабоадгезированных по формуле K₂=(X₁-X₂)/X·100% , где X₁ - среднее значение общего количества адгезированных кандид на 1 эпителиоците после инкубации; X₂ - среднее значение количества количества адгезированных кандид на 1 эпителиоците после центрифугирования и при значении K₁>50 оценивают кандиды как прочноадгезированные, а при K₂>50 - как слабоадгезированные.

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, и может быть использовано с целью изучения одного из ключевых механизмов взаимодействия между клетками макроорганизма и микробами с позиций потенциальной болезнетворности микроорганизмов, резистентности макроорганизма, а также влияния на этот процесс различных факторов.

Адгезия - полидетерминантный признак как с точки зрения поверхностных свойств штамма, так и с позиций свойств клеток, на которых она происходит. Адгезия реализуется на основе комплекса специфических (лиганд-рецепторных) и неспецифических (физико-химических) взаимодействий между микробными и эпителиальными клетками, инициируя колонизацию слизистых оболочек [1, 2] .

Большинство инфекций начинается со слизистых оболочек и включает обязательный этап - колонизацию эпителия, ключевым эпизодом которой является закрепление, или адгезия микробных клеток на эпителии [3, 4, 5, 6] .

От характера взаимоотношения микробной клетки с клетками слизистой, отражением чего является прочность связывания, зависит обратимость процесса колонизации, а также дальнейшее развитие и течение инфекционного процесса [7] .

Большая часть информации об адгезивном процессе получена при совместной инкубации эпителиоцитов и бактериальных клеток в суспензии в опытах [2] .

Наиболее часто интенсивность адгезии оценивается средним количеством микробных клеток, находящихся на одном эпителиоците. Чем больше микробов адсорбировано на клетке, тем больше их адгезивная способность. Однако, несмотря на широкое использование суспензионного теста, ряд закономерностей адгезивного процесса, в том числе прочность связывания клетки-"хозяина" и микроорганизма, остаются неизученными [8] .

За прототип предлагаемого изобретения выбран способ оценки адгезии микроорганизмов, включающий способ оценки адгезии микроорганизмов на эпителиоцитах путем инкубации микроорганизмов с эпителиальными клетками, отмывки их от несвязавшихся микробов изотоническим раствором и подсчета адсорбированных микроорганизмов в пересчете на один эпителиоцит [9] .

Способ заключается в том, что изучали адгезивную способность различных штаммов C. albicans. Использовали смесь буккальных эпителиальных клеток от нескольких доноров в концентрации 2^.10⁵ в одном миллилитре и смешивали с равным объемом взвеси C. albicans в концентрации 1^.10⁸ клеток в одном миллилитре, инкубировали при покачивании в течение 1-3 ч при 37^оС. Клетки отмывали на поликарбонатных фильтрах, фиксировали метанолом и окрашивали кристалл-виолеттом. Считали не менее 100 буккальных клеток и определяли количество кандид в пересчете на одну клетку. Высокоадгезированным штаммом является тот, который прилипает к одной эпителиальной клетке в большем количестве.

Недостатком способа - прототипа является его низкая информативность, т. к. с помощью этого метода лишь констатируется факт прикрепления микробов на клетку, но оценка характера этой взаимосвязи не дается. Однако судьба инфекционного процесса зависит от этих взаимоотношений. С помощью данного способа не возможно выявить из общего числа адгезированных микробов прочно связанные с клеткой и влияющие на возникновение инфекционного процесса, а также слабоадгезированные, которые, возможно, не вносят ощутимого вклада в его развитие и течение.

Целью предлагаемого способа является повышение информативности способа за счет определения количества прочно- и слабоадгезированных микроорганизмов.

Цель в способе оценки адгезии микроорганизмов на эпителиоцитах, включающая инкубацию микроорганизмов с эпителиоцитами, с дальнейшей отмывкой эпителиоцитов от несвязавшихся микробов изотоническим раствором и подсчета адгезированных микроорганизмов в пересчете на один эпителиоцит, достигается тем, что, с целью повышения информативности способа за счет определения количества прочно- и слабоадгезированных микроорганизмов, дополнительно проводят центрифугирование отмытых эпителиоцитов через градиент плотности фиколл-верографин и после подсчета оставшихся на эпителиоцитах адгезированных микроорганизмов определяют процентное содержание прочноадгезированных микроорганизмов по формуле К₁= X₂/X₁·100% , а слабоадгезированных по формуле К₂= 10% , где Х₁ - общее количество адгезированных микроорганизмов на одном эпителиоците после инкубации (среднее значение), Х₂ - количество сильноадгезированных микроорганизмов на одном эпителиоците после дополнительного центрифугирования (среднее значение) и при значении К₁>50 выносят суждение о преобладании прочноадгезированных, а при значении К₂>50 о преобладании слабоадгезированных микроорганизмов.

В случае оценки адгезии грибов рода Candida проводят центрифугирование отмытых эпителиоцитов после инкубации через градиент фиколл-верографин с плотностью 1.077 в течение 10-20 мин при 30-50g.

Все отличительные признаки являются существенными для достижения поставленной цели: ликвидация какого-либо признака, либо замена его на другой приводит к тому, что поставленная цель не достигается.

Первым отличительным признаком является использование фиколл-верографина для дополнительного дифференциального центрифугирования. Необходимость использования фиколл-верографина доказана теоретически и экспериментально.

Между величиной и плотностью клеток существует тесная взаимосвязь. Обычно меньшие по размеру клетки обладают относительно меньшим объемом цитоплазмы по сравнению с ядром и следовательно, большей плотностью. Клетки буккального эпителия значительно превышают по своим размерам кандиды. Клетки, различающиеся по величине и плотности, могут быть разделены методом изопикнического или изокинетического центрифугирования, а также осаждением в градиенте плотности. В случае изокинетического центрифугирования и осаждения клеток в менее плотном градиенте клетки с большим диаметром седиментируются быстрее. При разделении клеток надо выбирать растворы таких веществ, которые обладают незначительным осмотическим давлением во избежание повреждения разделяемых клеток. Фракционирование клеток различной величины чаще всего проводят в градиенте плотности фикола, фиколла-верографина, альбумина, сахарозы и др. Данные градиенты используются для разделения различных популяций клеток крови, т. е. родственных по происхождению, для исследования в дальнейшем их функциональной роли, их кооперативного взаимодействия, дифференцировки и т. д. Использование градиента плотности для разделения неродственных клеток в литературе не встречалось.

Условия центрифугирования в градиенте, т. е. плотность (1,077), время (10-20 мин), скорость (30-50g), в предлагаемом способе подбирались в процессе работы. Обычно разброс величины плотности по литературным данным варьирует в пределах 1,04-1,12 г/мл. При величине плотности больше 1,077 (1,08) клетки буккального эпителия не оседали, а зависали над градиентом, при плотности меньше 1,077 (1,07-1,06) эпителиальные клетки полностью оседали со всеми адгезированными на них кандидами.

Необходимость проведения центрифугирования в течение именно 10-20 мин также доказано экспериментально. Если использовать время меньше, чем 10 мин, то клетки оседают на разделе двух фаз (фиколл-физиологический раствор) и не входят в градиент плотности. Испытывались условия - 5 мин, 7 мин, 9 мин. При центрифугировании более 20 мин, наблюдается также полное оседание эпителиоцитов, но осадок становился более плотным, что затрудняло приготовление качественного мазка. Испытывались режимы 25, 30, 40 мин. Таким образом, 10-20 мин - время вполне достаточное для проведения полноценного дифференциального центрифугирования.

Скорость центрифугирования 30-50g необходима и достаточна для осаждения эпителиоцитов при проведении дифференциального центрифугирования. Испытывались режимы менее 30g, т. е. 20g. В этом случае не выполнялась задача этого этапа, так как эпителиоциты не входили в градиент плотности, а оставались на границе раздела градиента и физиологического раствора. При более высокой скорости центрифугирования буккальный эпителий может деформироваться, что искажает конечный результат. Испытывались режимы - 60, 70g.

Для доказательства соответствия предлагаемого изобретения критерию "существенные отличия" проанализирована литература по известным ранее областям применения градиента плотности фиколл-верографина и проявляемым свойствам. Установлено, что ранее он использовался только для разделения двух субстанций в одном объеме, но не связанных друг с другом; например - для разделения субпопуляций клеток крови, где результат разделения зависит исключительно от физических свойств разделяемых субпопуляций, т. е. от самих клеток.

В предлагаемом способе впервые показано, что фиколл-верографин может использоваться для разделения неродственных клеток, не просто находящихся в одном объеме, но связанных друг с другом; в этом случае результат разделения определяется силой сцепления и потому может служить для оценки адгезии микроорганизмов. Установление этого свойства считают определяющим для соответствия изобретения критерию "существенные отличия".

Положительный эффект предлагаемого способа заключается в том, что впервые создается возможность выявления среди общего количества адгезированных микроорганизмов прочно- и слабоадгезированных, определения их процентного соотношения, что повышает информативность оценки адгезии как процесса взаимодействия клетки-"хозяина" с микроорганизмом. При этом предлагаемый способ достаточно прост в осуществлении, непродолжителен во времени.

Способ осуществляется следующим образом.

Получают клетки буккального эпителия, для чего стерильной ложечкой делают соскоб буккального эпителия с внутренней стороны щек и получают взвесь клеток в изотоническом растворе, дважды отмывают (30g, 5 мин) и готовят взвесь с концентрацией клеток 1^.10⁶ в мл.

В качестве микробного объекта используют дрожжеподобные грибы рода Candida, которые выращивают на питательной среде Сабуро в течение 18-20 ч при 37^оС. С посевов делают смыв изотоническим раствором, инактивируют 0,4% формалином. Хранят взвесь кандид в изотоническом растворе при t= +4^оС. Перед опытом кандиды отмывают 1-2 раза (50 g, 30 мин). В опыт берут кандиды в концентрации 1^.10⁹ клеток в 1 мл.

Постановка реакции. Взвесь эпителиоцитов в изотоническом растворе смешивают с равным объемом взвеси кандид и инкубируют в течение одного часа при 37^оС в шюттель-аппарате. Неприкрепившиеся к буккальному эпителию кандиды удаляют путем трехкратного центрифугирования при 30 g, 5 мин. Затем взвесь отмытых эпителиоцитов с адгезированными кандидами вновь центрифугируют на градиенте фиколл-верографин с плотностью 1,077, предварительно сделав контрольный мазок (мазок 1). Осадок клеток эпителия отмывают изотоническим раствором от фиколл-верографина и отделившихся кандид в режиме 30 g, 5 мин, делают второй мазок (мазок 2), фиксируют смесью Никифорова и красят раствором генцианового фиолетового. Затем подсчитывают количество адгезированных кандид на одном эпителиоците, просматривая таким образом 100 клеток в мазках 1 и 2, выводя среднюю величину. При микроскопировании мазков количество кандид, адгезированных на буккальном эпителии в мазке 2, в 5-10 раз меньше чем в мазке 1. Это можно объяснить тем, что наименее прочные связи между эпителиальными клетками и кандидами нарушаются при вхождении в градиент и на клетке остаются только прочноадгезированные. Процент прочноадгезированных микроорганизмов определяют по формуле К₁= X₁/X₂ ^.100% , а слабоадгезированных по формуле К₂= 100% . Если значение К₁>50, то делают вывод о том, что на эпителиоцитах после проведенной адгезивной реакции находится больше прочноадгезированных кандид. Если значение К₂>50, то делают вывод, что на эпителиоцитах после проведенной адгезивной реакции находится больше слабоадгезированных кандид.

П р и м е р 1. Выписка из протокола N5. Исследовались клетки здорового донора Б. После проведенной адгезивной реакции и дифференциального центрифугирования получено два мазка. При микроскопировании мазка 1 выявлено, что в среднем на одну эпителиальную клетку приходится 10 кандид (пределы колебаний 0-12) - общее количество прочно- и слабоадгезированных кандид на эпителиоците.

При микроскопировании мазка 2 определено, что на одну эпителиальную клетку в среднем приходится 2,6 кандид (пределы колебаний 0-6) - оставшиеся прочноадгезированные кандиды.

Процентное содержание прочноадгезированных кандид высчитываем по формуле К₁= (2,6/10,0)·100% , К₁= 26% , а слабоадгезированных по формуле К₂= ^.100% , К₂= 74% , что говорит о преобладании на эпителиоцитах после адгезивной реакции слабоадгезированных микроорганизмов.

П р и м е р 2. Выписка из протокола N 11. Исследовались клетки здорового донора Л. После проведения всех этапов реакции и оценки 100 эпителиоцитов в мазке 1 выявлено, что в среднем на один эпителиоцит приходится 6,0 кандид (пределы колебаний 0-15) - общее количество прочно- и слабоадгезированных кандид на эпителиоците.

При микроскопировании второго мазка (мазок 2), полученного после дополнительного дифференциального центрифугирования через фиколл-верографин и оценки 100 эпителиальных клеток получено, что на один эпителиоцит прикрепляется в среднем 3,6 кандид (предел колебаний 0-10), что отражает количество прочноадгезированных микроорганизмов. Процентное содержание прочноадгезированных кандид по формуле К₁= (3,6 /6,0)/^.100% , К₁= 60% , а слабоадгезированных по формуле К₂= 100% , К₂= 40% , ^.т. е. количество слабоадгезированных микроорганизмов на эпителиоците незначительно превышает прочноадгезированные.

Всего с помощью предлагаемого способа проведено 50 исследований. (56) 1. Infect a Immun, - 1977, vol. 9, N 1, p. 85-92.

2. Infect a Immun, 1978, vol. 22, N 1, p. 247-254.

3. Успехи современной биологии, 1985, т. 99, N 3, с. 420-434.

4. Успехи современной биологии. 1985, т. 94, N 2, с. 213-224.

5. Журнал микробиология, 1984, N 7, с. 77-85.

6. Ann. Rev. Microbiol. 1975, vol. 29, p. 19-44.

7. Журнал микробиология, 1989, N 9, с. 103-107.

8. Журнал микробиология, 1987, N 5, с. 28-32.

9. Infect. a Immun. , 1978, vol. 21, N 1, p. 64-68.

Формула изобретения

СПОСОБ ОЦЕНКИ СТЕПЕНИ АДГЕЗИИ ГРИБОВ РОДА CANDIDA НА ЭПИТЕЛИОЦИТАХ путем инкубации кандид с эпителиоцитами, отмывки эпителиоцитов изотоническим раствором и подсчета адгезированных кандид в пересчете на один эпителиоцит, отличающийся тем, что после инкубации дополнительно проводят центрифугирование отмытых эпителиоцитов в градиенте фиколл-верографина с плотностью 1,077 в течение 10 - 20 мин при 30 - 50g, определяют процентное содержание прочноадгезированных кандид K₁ по формуле K₁= · 100 % , а слабоадгезированных K₂ по формуле K₂= · 100 % , где X₁ - среднее значение общего количества адгезированных кандид на одном эпителиоците после инкубации; X₂ - среднее значение количества адгезированных кандид на одном эпителиоците после центрифугирования, и при значении K₁ > 50 оценивают кандиды как прочноадгезированные, а при K₂ > 50 - как слабоадгезированные.