Способ выявления микобактерий

 

Использование: микробиология, молекулярная биология и биохимия, в частности способ дифференциации различных видов микобактерий, в частности возбудителя туберкулеза . Сущность изобретения: ДНК бактериофага М13 содержит в своем составе уникальные, повторяющиеся последовательности нуклеотидов. Такие последовательности имеют место и в ДНК микобактерий туберкулеза. Они обнаруживаются рестрикцией ДНК микобактерий туберкулеза , электрофорезом их и гибридизацией ДНК-зондом М 13. Расположение полос (участков уникальных последовательностей нуклеотидов) является специфичным для каждого вида микобактерий туберкулеза и позволяет дифференцировать их. 1 ил.

(я)5 С 12 0 1/68. С 12 N 15/31

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ и ".",,",,""

И gp,(т-, К ПАТЕНТУ

О

О

О (21) 4942381/13 (22) 04.06.91 (46) 07.09.93. Бюл. N 33 — 36 (71) Казанский ветеринарный институт им.

H.Ý.Áàóìàíà (72) Шилова В.И., Фаизов Т.X.. Алимов А.M., Хазипов Н.З. (73) Ш о В,И. (56) Артюшин С.К., Фомин Б.А. и др. Бюл, ВИЭВ, 1987, 64, с.52 — 54. (54) СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА (57) Использование: микробиология, молекулярная биология и биохимия, в частности

Изобретение относится к микробиологии, молекулярной биологии, биохимии, в частности к способу дифференциации и идентификации различных видов микобактерий туберкулеза, и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях.

Известен способ дифференциации микобактерий, основанный на методах биологических, бактериологических и биохимических исследований. Эти комплексные исследования включают скорость роста; образование пигмента (на свету или в темноте); способность к росту на простых питательных средах и при температуре 2025 С; каталазная активность; пероксидаэная активность; термостабильность каталазы; первичная устойчивость к препаратам первого ряда — стрептомицину, изониаэиду, ПАСК. Важную информацию дают

„„RU „, 2000331 С способ дифференциации различных видов микобактерий, в частности возбудителя туберкулеза. Сущность изобретения: ДНК бактериофага М13 содержит в своем составе уникальные, повторяющиеся последовательности нуклеотидов, Такие последовательности имеют место и в ДНК микобактерий туберкулеза. Они обнаруживаются рестрикцией ДНК микобактерий туберкулеза, электрофорезом их и гибридизацией ДНК-зондом М 13. Расположение полос (участков уникальных последовательностей нуклеотидов) является специфичным для каждого вида микобактерий туберкулеза и позволяет дифференцировать их, 1 ил. опыты на животных. Данный метод является трудоемким и продолжительным (до 3 мес.).

Кроме того, известен метод идентификации микобактерий путем определения нуклеотидного состава ДНК по температуре плавления, степени подобия нуклеотидных последовательностей в сравнении между собой, где требуется клонирование фрагментов известного ДНК, создание рекомбинантных ДНК-зондов на плазмидных векторах.

Данный метод мы рассматриваем в качестве прототипа.

Недостатками рассматриваемого способа являются большая сложность и трудоемкость, связанная с фрагментированием и клонированием специфических участков

ДНК и отсутствием универсальности получаемых ДНК-зондов, т.е. необходимости

2000331 разработки ДНК-зондов, специфичных для каждого аида микобактерий.

Целью изобретения является упрощение и повышение надежности и специфичности способа дифференциации возбудителя туберкулеза крупного рогатого скота Ы,Bovls от атипичных форм микобактерий на основе универсального ДНК-зонда, а также межвидовая дифференциация микобактерий туберкулеза. 10

Это достигается применением метода определения гипервариабильных последовательностей в геноме микобактерий с помощью ДНК-зонда, приготовленного из

Д Н К ба кте риоф ага М13. 15

Сущность изобретения состоит в том, i To, используя зонд из ДН К бактериофага М

13, устанавливают гипервариабильные участки ДНК генома микобактерий, которые имеют различную локализацию во фрагмен- 20 тах ДНК в зависимости от их видимрй принадлежности.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что применение фермента рестрикции Есо 91 1 и зонда из ДНК бактериофага М13 позволяет определить гипервариабильные участки ДНК различных видов микобактерий, что дает возможность установить из видовую принадлежность. 30

Таким образом, заявленное техническое решение соответствует критерию новизна.

По сравнению с прототипом, где требуется клонирование фрагментов известного

ДНК, создание рекомбинантных ДНК-зондоо на плазмидных векторах, созданный универсальный зонд из ДНК бактериофага

М I3, благодаря рестриктаэе Есо 91 1. дающей широкий спектор гибридизирующих 40 полос, дает воэможность определения и распознавания микобактерий от патогенного штамма и друг от друга, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию существенные отличия. 45

Из бактериальной массы каждого вида микобактерий выделяют ДНК, обрабатывают их рестриктаэой Есо 91 1 и подвергают электрофорезу о горизонтальном блоке

0,8%-ного агароэного геля с последующим 50 блоттингом по Сазерну и ДНК-ДНК гибридизацией с ДНК-зондом М13.

1. Выделение хромосомальной ДНК из патогенного штамма M.Bovls, атипичных микобактерий M.kansasll, М lntracellulare и 55 сапрофитного M.phlel.

Бактериальную массу в количестве 1 мг

2 раза отмывали в 10 мл SSPE (ЗМ NaCI, 0,2М NaH2POn, 0,02М ЭДТА, рН 7.8), центрифугируя при 5 тыс. об/мин по 15 мин.

Осадок ресуспендировали в 5 мл разбавленного о холодном STE-1 буфере (0,1М NaCI, 0,01М трис-MCI. 0,01М ЭДТА, рН 7,8) лизоцима (14 мг/мл). Тщательно перемешивали и инкубировали при температуре 37 С в течение 30 — 40 мин. После этого добавляли 500 мкл водного раствора пронаэы (1 мгlмл) и

500 мкл 10 додецилсульфатэ натрия (SDS), перемешивали и инкубировали при температуре 50 С во встряхивающем аппарате в течение 30 мин. Лизис клеток микобактерий сопровождался уоеличением вязкости раствора. По окончании лиэиса клеток в смесь добавляли 5M NaCI до конечной концентрации 1М.

Очистку от белка осуществляли добавлением раиного обьема хлороформа: иэоа лилооого спирта (24:1). Осторожно и плавно перемешивали о течение 10 мин и центрифугировали при 6 тыс. об/мин в течение 20 мин, Супернатант осторожно отсасывали о другую пробирку и последнюю процедуру повторяли до исчезновения белого налета на границе между хлороформом и основным субстратом. После удаления белков ДНК осаждали добавлением двух обьемов холодного 96О этанола. ДНК собирэли стеклянной палочкой и растворяли в

0,1xSSC и обраба1 ыоали РНК-эой из расчета

50 мкл на 1 мл в течение 1 ч при температуре

37 С. Добавляли 10%-ный додецилсульфат натрия до конечной концентрации 0,5М, проназу в концентрации 500 мкг на 1 мл.и инкубировали в термостате при температуре 37 С в течение 1 ч. После очистки ферментами ДНК экстрагировали равным обьемом хлороформ: иэоамилооый спирт (24: 1) при 6 тыс. об/мин в течение 20 мин.

Иэ супернатанта ДНК осаждали холодным

96 этанолом в соотношении 1: 2. ДНК наматывали на стеклянную палочку, высушивали на воздухе при комнатной температуре и растворяли о кипяченной бидистиллирооанной воде. На спектрофотометре "PerkinElmer" определяли концентрацию выделенных ДНК, 2. Фрагментация видов микобактерий рестриктазой Есо 91,1, дающей широкий спектр гибридиэирующих полос, электрофорез и блоттинг.

Очищенный от белков ДНК микобактерий в количестве 5 мкг переносили в пробирки эпиндофора. Туда же добавляли до 18 мкл бидистиллирооанной воды, 2 мкл 10х буфера рестрикции (50 мМ NaCI, 10 мМ трисkCI, рН 7,5, 10 мМ МоС4, 5 MM 2-меркаптоэтанол) и осторожно перемешивали. Затем вносили 3 мкл рестриктаэы Есо 91 1, перемешивали и помещали на 3 ч в термостат при температуре 37 С. Реакцию останавли2000331 вали добавлением ЭДТА до конечной концентрации 10 мМ.

Полученные фрагменты ДНК подвергали электрофорезу в горизонтальном блоке

0,8 -ного агарозного геля при напряжении 5

0.8 Вlсм в течение 16 ч.

Фрагменты ДНК окрашивали в растворе этидиум бромида в течение 30 мин и фотографировали.

Следующим этапом работы является 10 блоттинг, т.е. перенос фрагментов ДНК иэ агарозного геля на нитроцеллюлозную мембрану. Для денатурации ДНК гель выдерживали в 0.5 М NaOH с 1.5 М NaCI в течение 1 ч при постоянном покачивании. Затем про- 15 мывэли носк >л!) ко раз лис7>",ллl"," >ванной водой и внопь выдерживали в 0,5 M трисНС1, рН 0,0 с 1,5 М ИэС! с;ече>сна 1 ч с последующей отлсь>пкой дс1стиллирспэсс сой водой. 20

Для проведпнил блоттинга нэ столик электрофоретического аппарата нэклэдывали 4 слоя фильт ропэльной бумаги тэк, стобы она списэлэ и камеру длл буфсра.

Фильтровальную бумагу смачивали 10xSSC 25 и удаляли пузырьки воздухэ при помощи стеклянной палочки. Нэ >ильтропэльную бумагу эккурэтно нэклэдыпэли пластину агэрозы тэк, чтобы не было пузырь".îD воздуха. Работу проводили в резиновых пер- 30 чэтках. Нитроцеллюлэзную мсмбрэну (диаметр пор 0,45 мкм) гсредпэрисельссо выдерживали в дистиллированной воде при темперэтуре 90 С и течение 5 «»<, Затем мембрану накладывали на эгарозу соответ- 35 ствующей ей рэзмсросл, По крэлм эгарозы помещали полоски полиэтиленовой пленки.

Мембранный фильтр покрывали 4-0 слоями фильтровальной бумаги, вырезанной по размеру пласт1ны, Сверху наклэдывэли 2 40 сухих вафельных гсолотонцэ, сложенных по размеру, а нэ них устэн".вливали груз с сэссой 1 кг, В емкоссь для буфера ссэлипэли

10xSSC и выдерживали 16 ч при комнатной температуре. Послс блоттингэ нитроцеллю- 45 лозную мембрану снимали, выдержипэли 5 мин в GxSSC и высушивали па воздуха при комнатной температуре 30 мин. Зателс "запекали" мембрэссу под вакуум при температуре 00 С в теченис 2 ч. 50

Дальнейшим этапом рэботы является проведение гибридизации, где в качестве зонда используется меченый ДНК бэктериофага М13, 3. Приготовление меченого ДНК М13, К 55

0,5 мкг ДНК М13 добэвллли секвенсопый праймер 0 количестпе 2 мкл и еще 1 мкл буфера для ник-трансляции (10х), 10х буфер содержит 0,1 М трис-HCI, рН 7,5, 0,1 М

MgCIz, 1 M ИэС!, 0,005 M 2-меркэптаэтанол, 0,1 тритон х-100. Вышеуказанную смесь ставили в термоствт при температуре 65ОС на 10 мин, а затем выдерживали при комнатной температуре 30 мин. Зв это время происходит "отжиг" праймера с ДНК М13.

В пробирку с высушенной меткой (50 мкКи (Р|дТТФ) добавляли 8 лькл смеси немеченных трифосфатов (до 200 мкмоль), 1 мкл 10х буфера для ник-трансляции. 2 мкл фрагмента Кленова и весь ДНК М13. Смесь выдерживали в течение 1 ч при комнатной температуре.

Зонд очищали от невключившихся трифосфатов колоночной хроматографией йа сефадексе 6-50. Удельная активность зонда определллэсь на сцинтилляционном счетчике, которая была равна в нашем опыте

2 10 имп./глин мкг ДНК, 4. Предгибридизация и гибридизация.

Ннтроцеллюлозную мембрану с фрагментами ДНК запаивали в полиэтиленовый пакет и ьлприцем вводили 17,2 мл предгибридизацс виной сглеси.

Состав предгибридизационной смеси, мл:

20х SSC 10

20 (. 505 0,2

50х 0спсЬэгд 2

Дистиллироссас ссэя вода 5

После внесения смеси раствора из пакета удэлллп пузырьки воздуха, плотно за крепляли скрепками и зыдерживали в водяной бане при температуре 65 С в течение 2 ч.

После этого прецгибридизационную смесь сливали и вносили в пакет гибридизационную смесь в количестве 10 мл с меченным зондосл и оставляли Hà 16 ч при темп рагуре 65 С.

Для отмывки фильтров после гибридизации iêïoëüçîâàëè смесь следующего сосгэпэ. мл:

20х .>э5С 50

>0/, GDS 5

Дистиллироаассная вода 945

После гибридизации пакет вскрывали, вылипэли смесь в емкость для радиоактивных отходов и отмывали. Фильтр помещали

t3 и сlсночку, за сипалс1 200 мл отмывочного рэсгпорэ и выдерживали 1 ч при температура 65 С. Повторяли эту процедуру 2 раза.

Чистоту отмывки проверяли на приборе

УИМ 2-2. Зателс мембрану высушивали и помещэли ь рентгенкассету с рентгенпленкай и оссэпллли в холодильнике при температуре -70 С «а 16 ч. По истечении времени экспозиции пленку проявляли и делали, отос >смки (чертеж 1), Нэ чертеже изображен радиоавтогра4>ический снимок расположения гипервари2000331 — 15mn.и, — 2mn.í.

-9/n.п.í

7mn.и

5mn и

Составитель И.Куэенкова

Техред М.Моргентал Корректор М.Максимишинец

Редактор Л.Павлова

Тираж Подписное

НПО "Поиск." Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Заказ 3065

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. ужгород, ул.Гагарина, 101 абильных последовательностей нуклеотидов после блот-гибридизации фрагментов

ДНК различных аидов микобактерий туберкулеза, расщепленных рестриктазой Есо 91

В радиоавтографическом снимке четко видны специфические для каждого вида микобактерий расположения полос.

Сравнительный анализ гипервариабильных участков различных видов туберкулеза показывает, что М.Sovis отличается от остальных видов наличием дополнительных мажорных фрагмен ов в области 21, 19, 16 тысяч пар нуклеотидов (ТПН) и минорных фрагментов в области 20, 14, 11 тпн;

М.kansasll дополнительно имеет мажорных фрагментов в области 17,7,5,3ТПН, а также отличается наличием минорных фрагментов в области 13; М.phlel отличается от остальных наличием минорных фрагментов в области 15, 10. 6 TllH; M.lntracellulare отличается наличием минорных фрагментов в области 16 ТПН.

Технико-экономическая эффективность предложенного метода дифференциации заключается в том, что установление видовой принадлежности микобактерий туберкулеза важно при проведении противоэпиэоотических и противоэпидемиологических мероприятий, а также для диагностики ту5 беркулеэа. Замена громоздких и трудоемких методов исследований по дифференциации видов микобактерий надежным и воспроизводимым способом способствует сокращению времени

10 исследований, снижению затрат труда и расхода большого количества реактивов, повышает надежность и специфичность определения видов микобактерий.

Формула изобретения

15 Способ выявления микобактерий, предусматривающий выделение ДНК из исследуемых микробактерий, проведение гибридизации с ДНК-зондом, о т л и ч à ю щи и с я тем, что перед гибридизацией ДНК

20 микобактерий расщепляют рестриктазой

Есо91.1, полученные фрагменты расщепляют гель-электрофорезом, перейосят на нитроцеллюлоэные фильтры, в качестве ДНК зонда используют ДНК фагла М13, а выяв25 ление микобактерий осуществляют по расположению гипервариабел ьных участков.