Способ хроматографического анализа смеси аминокислот и пептидов

 

Использование: изобретение относится к использованию карбоксильных катионов для разделения сложных природных смесей аминокислот и пептидов методом ионозадерживающих процессов и может быть использовано в биотехнологии, микробиологии и сельском хозяйстве. Сущность изобретения: проводят элюирование аминокислот и пептидов из колонки, заполненной сорбентом-фумаратом, дистиллированной водой. Соли и кислоты из хроматографической колонки, заполненной сорбентом-фумаратом, выходят раньше.

Изобретение относится к использованию карбоксильных катионитов для разделения сложных природных смесей аминокислот и пептидов методом ионозадерживающих процессов и может быть использовано в биотехнологии, микробиологии, биохимии, медицине и сельском хозяйстве для технологических процессов разделения аминокислот и пептидов, а также для аналитических целей при анализе свободных аминокислот, амидов и пептидов в растительном сырье и физиологических жидкостях.

Известен способ разделения аминокислот и пептидов с помощью ионозадерживающих смол, созданных на основе сополимеров стирола и дивинилбензола, на ароматическую основу которых привиты катионо- и анионообменные группировки (1).

Недостатком этого способа хроматографии аминокислот и пептидов является то, что в нем используются буферные водные и неводные растворы, от которых при получении очищенных веществ впоследствии трудно освободиться.

Кроме того использование буферных растворов сопряжено с большими материальными затратами на приобретение нужных реактивов специальную очистку их от примесей и сопутствующих им соединений.

К тому же метод ионозадерживающих процессов требует использования весьма длинных колонок и значительного времени на проведение одного цикла разделения целевых веществ.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ разделения аминокислот и пептидов на смоле АG11А8. В способе используются водные и неводные растворы (2).

Недостатком способа является то, что регенерация указанных ионозадерживающих смол требует использования как щелочных так и кислотных реактивов, что вызывает трудности в препаративных работах и в отношении автоматизации процессов хроматографии, регенерации колонок и ввода в них образцов.

Цель изобретения - упрощение и повышение качества разделения.

Поставленная цель достигается тем, что в способе хроматографии аминокислот и пептидов используется сорбент - слабокислый карбоксильный катионит-фумарат, а в качестве элюента используется дистиллированная вода.

В известных способах благодаря бифункциональной природе сорбента происходит неадэкватное удерживание им различных аминокислот, пептидов и простейших белков. С особым успехом такие сорбенты применяются в тех случаях, когда существует потребность отделения различных солей от смеси аминокислот, пептидов и амидов. При этом используются буферные растворы, от которых впоследствии трудно освободиться при получении очищенных веществ. При этом метод ионозадерживающих процессов требует использования весьма длинных колонок и затраты значительного количества времени.

Сущность заключается в использовании в качестве элюента дистиллированной воды, не содержащей буферных растворов и органических растворителей.

П р и м е р 1. В колонку 0,8х30 см вносят карбоксильный катионит ПЭФ2ОДТ в Н-форме. Слой сорбента промывают водой и на его поверхность наносят по 0,1 мг следующих солей: хлористый натрий, хлористый калий и (или) хлористый аммоний. Колонку элюируют дистиллированной водой со скоростью 15 мл/ч под давлением 2 атм при комнатной температуре. Элюат собирают фракциями по 0,5 мл; в каждую фракцию вносят по 2 капли водного раствора азотнокислого серебра. По выпавшему белому осадку (турбидиметрически) определяют объем элюата, в котором вышла данная соль и ведется количественная оценка концентрации соли во фракциях содержащих ее.

Результаты определения показаны на графике.

П р и м е р 2. В ту же колонку размерами 0,8х30 см с катионитом ДПФ2ОДТ в Н форме вносят по 0,1 мг следующие аминокислоты: оксипролин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, серин, треонин, глутатион, глутамин, глицин, аланин, туберклопротеин, аспарагин, валин, пролин. Колонку элюируют водой со скоростью 15 мл/ч под давлением 2 атм при комнатной температуре. Элюат собирают в капельном коллекторе по фракциям 0,5 мл каждая. Выявление аминокислот и пептидов в элюате производится нингидриновым реактивом. Регенерация ионообменной смолы для последующего цикла хроматографии аминокислот и пептидов не требуется.

П р и м е р 3. В колонку 0,8х30 см вносят катионит ПЭФ2ОДТ (фракция с диаметром частиц 15-20 мкм) в Н-форме. Смолу промывают 20 мл дистиллированной воды и на поверхность наносят по 0,1 мг водного раствора основных аминокислот: лизин, гистидин, аргинин, ортинил. Колонку элюируют дистиллированной водой усовершенствованным раствором нингидрина.

Находят, что ни одна из основных аминокислот из смолы ПЭФ2ОДТ водой не элюируется.

Для регенерации колонки в этом случае требуется промыть колонку 1н гидроокисью натрия (10 мл), дистиллированной водой (20 мл), 1 н соленой кислотой (10 мл) и дистиллированной водой (20 мл), после чего колонка готова к очередному циклу разделения по методике одного трех описанных выше примеров.

Преимущества способа заключаются в следующем.

Элюирование аминокислот и пептидов из колонок, заполненных сорбентами-фумаратами, проводится дистиллированной водой без использования буферных растворов и органических растворителей. Не требуется регенерация катионита для проведения очередного цикла разделения аминокислот. Создается возможность обессоливания водных растворов аминокислот. Сокращается время на проведение одного цикла разделения и уменьшаются материальные затраты на проведение хроматографического процесса.

Формула изобретения

СПОСОБ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО АНАЛИЗА СМЕСИ АМИНОКИСЛОТ И ПЕПТИДОВ, включающий ионообменное разделение на колонке с ионообменным сорбентом в потоке элюента, отличающийся тем, что, с целью упрощения и повышения точности анализа, в качестве ионообменного сорбента используют карбоксильный катионит-фумарат, а в качестве элюента - дистиллированную воду.