Штамм бактерий rhizobium galegae для получения удобрений под козлятник лекарственный

 

Использование: изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, получение средств повышения урожайности бобовых культур и касается нового штамма бактерий для их производства. Сущность изобретения: штамм бактерий Rhizobium galigae выделен из клубеньков растений козлятника лекарственного, идентифицирован по определителю бактерий Берги, депонирован в коллекции ВНИИСХМ под N 0716. Для получения удобрения штамм выращивают на бобовом агаре при 28°С в течение 3 сут. Клетки смывают стерильной водой и используют в качестве инокулюма. Суспензию клеток можно смешивать с торфом и полученный препарат использовать для обработки семян козлятника. 4 табл.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к микробиологическим средствам повышения урожайности бобовых культур.

Козлятник лекарственный (Galega officinalis) - травянистое многолетнее бобовое растение, используется в медицине, Алкалоиды, содержащиеся в травянистых побегах растения, способствуют понижению сахара в крови при сахарном диабете. Трава козлятника лекарственного входит в состав лекарственных сборов, показанных при данной болезни. Естественные популяции козлятника лекарственного не покрывают потребностей в сырье, поэтому его вводят в культуру в хозяйствах, ориентированных на выращивание лекарственных растений.

Важнейшей биологической особенностью козлятника, как и всех бобовых культур, является его способность использовать атмосферный азот в симбиозе с клубеньковыми бактериями, благодаря чему значительную часть потребности в этом элементе он может удовлетворять за счет биологической азотфиксации. Однако, при введении козлятника в культуру, когда он впервые высевается в севообороте, происходит только незначительное инфицирование его корней природной популяцией клубеньковых бактерий, в связи с чем растения лишь частично реализуют свой природный азотфиксирующий потенциал. Для получения высоких урожаев в этих условиях необходимо применять минеральные азотные удобрения, что негативно влияет как на себестоимость продукции, так и на качество растительного сырья и экологическую обстановку.

Вместе с тем известно, что одним из резервов повышения продуктивности бобовых культур, в том числе и козлятника, может служить усиление у них процесса биологической азотфиксации путем обработки семян селекционными штаммами клубеньковых бактерий. Однако до настоящего времени активных и специфичных штаммов клубеньковых бактерий для усиления симбиотической азотфиксации у козлятника лекарственного не было предложено.

Козлятник лекарственный относится к роду Galega и является близким родственником козлятника восточного Galega orientalis. Исследовали способность клубеньковых бактерий козлятника восточного, штамм С702 [1] образовывать клубеньки на корнях растений козлятника лекарственного.

Оказалось, что этот штамм хотя и был вирулентен по отношению к козлятнику лекарственному, однако не был способен фиксировать молекулярный азот атмосферы в симбиозе с этим растением.

Целью изобретения является получение штамма Rhizobium galegae - активного азотфиксирующего микросимбионта козлятника лекарственного для усиления процесса симбиотической азотфиксации и повышения продуктивности этой культуры.

В качестве такого штамма предлагается штамм 0716 (ВНИИСХМ).

Штамм 0716 был выделен из клубеньков растений козлятника лекарственного, произраставшего на черноземе на Полтавской зональной станции лекарственных растений ВИЛР.

Штамм идентифицирован по определителю бактерий Берги и по статье К. Линдстрем [2].

Штамм Rhizobium galegae 0716 депонирован и хранится в коллекции клубеньковых бактерий ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии под номером 0716 (индекс коллекции во Всемирном каталоге коллекций Rhizobium С1АМ).

Штамм 0716 растет на следующих питательных средах.

1. Гороховый агар, г/л: горох 100,0; сахароза 20,0; агар-агар 20,0; рН среды 6,8-7,0.

2. Маннитно-дрожжевой агар, г/л: маннит 10,0; К₂НРО₄ 0,5; MgSO₄˙7H₂O 0,2; Nacl 0,1; дрожжевой экстракт 0,4; агар-агар 15,0; рН среды 6,6-7,0.

Морфолого-культуральные свойства. Бактерии штамма 0716 представляют собой грамотрицательные, мелкие палочки с закругленными концами, подвижные. Величина клеток пятисуточной культуры на маннитно-дрожжевом агаре 1,8-2,4 х 0,8-0,9 мкм. Культура быстрорастущая.

Штрих на маннитно-дрожжевом агаре обильный, беловатый, слизистый, стекающий. Колонии появляются на 3-4 сут. однотипные, белые, круглые, выпуклые, слизистые, 1-2 мм в диаметре.

Шрих на бобовом агаре обильный, беловатый, слизистый. Колонии появляются на 4 сут., однотипные, круглые, белые, выпуклые, слизистые, 1-2 мм в диаметре.

Физиолого-биохимические свойства.

Симбионт. Макросимбионт - бобовое растение козлятник лекарственный.

Отношение к: а) кислороду - аэроб; б) Т максимальная 35^оС; минималная 4^оС, оптимальная 26-28^оС; в) рН максимальный 7,5, минимальный 6,0, оптимальный 6,8-7,0.

Источник углерода g e Глюкоза A_к (-) Лактоза A_к (-) Мальтоза A_к (-) Сахароза A_к (-) Арабиноза A_к (-) Рамноза A_к (-) Галактоза A_к (-) Ксилоза A_к (-) Дульцит A_к (-) Сорбит A_к (-) Маннит A_к (-) Клетчатка - Крахмал - Источники азота NaNO₃ + (NH₄)₂SO₄ + МПА - Азот фиксирует в симбиозе с козлятником лекарственным.

Другие характерные физиологические особенности Желатину не разжижает.

Молоко с лакмусом не пептонизирует, слабо подщелачивает, вызывает образование слизистой зоны.

При 1,0%-ной концентрации NaCl в среде рост бактерий ингибируется, при 2,0% NaCl в среде не растет.

Признаки штамма устойчивы, штамм непатогенен.

Штамм 0716 хранится на бобовом агаре указанного состава при 4^оС и пересевается 1 раз в 6 месяцев.

Оценку симбиотических свойств штамма 0716 - вирулентности, азотфиксирующей активности и эффективности симбиоза проводили в условиях микровегетационных, вегетационных и полевых опытов.

Вирулентность определяли по количеству и качеству клубеньков, образованных на корнях козлятника лекарственного при инокуляции его клубеньковыми бактериями в условиях микровегетационного опыта.

Азотфиксирующую активность определяли по величине ацетиленредуктазной активности на интактных клубеньках.

Эффективность симбиотической азотфиксации определяли по общему накоплению азота растениями на сосуд. Этот показатель складывается из величины урожая зеленой массы растений козлятника и содержания в них азота, который определяли с помощью системы Къельтек-авто, Текатор (Швеция).

П р и м е р 1. Микровегетационный опыт.

В большие пробирки (200 х 20 мм) добавляют 12 мл агаризованной среды Красильникова-Кореняко, г/л: K₂HPO₄ 1,0; MgSO₄˙7H₂O 1,0; Ca₃(PO₄)₂0,2; FeSO₄ следы; смесь микроэлементов по М.В. Федорову 1 мл. Состав раствора микроэлементов, г/л: H₃ВО₃ 0,05; (NH₄)₂MoO₄ 0,05; KCl 0,005; NaBr 0,005; ZnSO₄˙7H₂O 0,003; Al₂(SO₄)₃·7H₂O 0,003; MnSO₄ 0,002. Пробирки со средой стерилизовали в автоклаве.

Семена козлятника лекарственного, сорт. "Старт", стерилизовали концентрированной серной кислотой в течение 10 мин, после чего обильно промывали стерильной водой и раскладывали на увлажненные стерильные бумажные фильтры в чашки Петри для прорастания. Через 3 сут проростки в асептических условиях раскладывали в пробирки со средой по 2 проростка. Опыты ставили в шестикратной повторности.

Клубеньковые бактерии для инокуляции растений выращивали на косяках с бобовым агаром указанного состава в течение 3 сут. при 28^оС и суспендировали в растворе микроэлементов. На следующие сутки после раскладки семян в каждую пробирку вносили по 1 мл инокулюма, содержащего 10⁷ клеток. Растения выращивали в фитотроне при 18-22^оС в течение 6 недель. По окончании периода вегетации ватно-марлевые пробки у пробиpок заменяли герметичными резиновыми колпачками, через которые вводили по 5 мл ацетилена в каждую пробирку. Через 1 сут. определяли прижизненную ацетиленредуктазную активность на газовом хроматографе "Цвет-100". Величину нитрогеназной активности клубеньков, которая характеризует азотфиксирующую активность штамма, выражают в микромолях С₂Н₄ за 1 сут. на 2 растения. Результаты представлены в табл.1.

Данные табл.1 показывают, что штамм 0716 вирулентен на козлятнике лекарственном, - он образует на его корнях типичные для этого растения клубеньки. Штамм клубеньковых бактерий козлятника восточного 0702 вирулентен на козлятнике лекарственном, однако образуемые им клубеньки неактивны, в то время как штамм 0716 является активным азотфиксирующим микросимбионтом козлятника лекарственного, на что указывает высокая ацетиленредуктазная активность.

Приведенные материалы свидетельствуют о том, что растения козлятника лекарственного способны вступать в эффективный симбиоз только со специфичными штаммами клубеньковых бактерий. Эти результаты полностью согласуются с данными, полученными другими авторами [3].

П р и м е р 2. Вегетационный опыт.

Опыт проводили на нестерильном речном песке в шестикилограммовых сосудах в пятикратной повторности. В каждый сосуд высаживали по 4 растения. Соли вносили по Прянишникову, г/кг песка: KCl 0,15; MgSO₄ x 7H₂O 0,06; CaHPO₄ 0,172; MnSO₄ 0,003; борная кислота 0,008; (NH₄)₂MoO₄0,001; NH₄NO₃ 0,24 (0,2 от полной нормы азота). Обработка семян перед посадкой - такая же, как и для микровегетационного опыта.

Для инокуляции семян чистую культуру бактерий выращивали на качалке в бобовом отваре при 28^оС в течение 2 сут. Выросшую суспензию наносили на семена козлятника лекарственного, разложенные в лунки, сделанные в песке каждого сосуда. В каждый сосуд вносили 20 мл суспензии титром 5 х 10⁷ клеток. Растения выращивали в летнем пленочном домике в течение 2 месяцев. Результаты представлены в табл.2.

Как видно из табл. 3 штамм 0716 вступает в эффективный симбиоз с козлятником лекарственным, усиливает у него процесс симбиотической азотфикcации, благодаря чему значительно возрастает урожай зеленой массы растений, содержание азота и качество растительного сырья.

П р и м е р 3. Получение препарата на основе штамма 0716.

Приготовление жидкой посевной культуры. Жидкую культуру выращивают на качалке в качалочных колбах в течение 2-3 сут. на среде следующего состава, мас. % : гороховый отвар 10,0; сахар пищевой 0,5. рН после стерилизации 6,4-6,8. Среду стерилизуют при 1 атм. 30 мин. Титр бактерий 4-5 млрд. клеток в 1 мл.

Для получения жидкой культуры штамм выращивают на косяках с бобовым агаром в течение 3 сут., выросшую массу клеток смывают стерильной водой и используют в качестве инокулюма. После микробиологического контроля культуральная жидкость из колб используется для смешивания с торфом.

Подготовка торфа. Размолотый низинный торф, нейтрализованный мелом до рН 6,8-7,0 с влажностью 30-40% в полиэтиленовых пакетах по 200-400 г, стерилизуют гамма-облучением при дозе 2,5 Мрад. Стерильный торф в пакетах инокулируют инъекцией культуральной жидкости из расчета исходного титра бактерий в торфе 0,15-0,8 млрд./г торфа и влажности 45-60%. Затем содержимое в пакетах перемешивается. Ризоторфин хранят при 10-15^оС в темном помещении отдельно от ядохимикатов.

Характеристика готового продукта.

Ризоторфин для козлятника лекарственного на предлагаемом штамме представляет собой по внешнему виду увлажненную сыпучую массу темного цвета, без запаха, не растворимую в воде. Ризоторфин содержит 3-4 млрд. бактерий в 1 г торфа. Срок годности препарата 6 мес. со дня изготовления. Расход препарата 200 г на гектарную порцию семян.

П р и м е р 4. Использование ризоторфина для обработки семян козлятника лекарственного.

Эффективность симбиотической азотфиксации штамма 0716 определена также в полевом опыте на базе НПО "ВИЛР" Почва дерново-подзолистая хорошо окультуренная. В предыдущем году был внесен навоз. Площадь делянки 80 м², повторность опыта четырехкратная. Внесены минеральные удобрения Р₁₂₀К₁₂₀.

Используют семена козлятника лекарственного. Семена обрабатывают ризоторфином, изготовленным на предлагаемом штамме. Доза препарата 200 г на гектарную порцию семян, титр препарата 4 млрд./г.

Способ внесения препарата: 200 г ризоторфина разводят в 1 л водопроводной воды, и, не давая суспензии отстаиваться, наносят ее на гектарную порцию семян. Затем семена тщательно перемешивают для равномерного распределения препарата. Обработанные ризоторфином семена высевают в тот же день во влажную почву.

Эффективность симбиотической азотфиксации штамма 0716 с козлятником лекарственным определяли по величине урожая зеленой массы растений, содержанию азота и по биометрическим показателям растений. Штамм 0716 является, как было показано выше, видоспецифичным по отношению к козлятнику лекарственному, а известный ранее штамм 0702 не давал эффективного симбиоза. Поэтому в полевом опыте было всего 2 варианта: контроль, где растения могли быть инфицированы природной популяцией ризобий, и вариант с инокуляцией штаммом 0716.

Результаты опытов представлены в табл. 3 и 4.

Как показывает табл. 3, обработка семян козлятника лекарственного ризоторфином на штамме 0716 способствует повышению урожая растений на 53,8% и накоплению азота на 55,8% (содержание азота не различалось, очевидно, вследствие высокого содержания его в почве).

Как видно из табл.4, обработанные семена характеризуются ускоренными темпами развития. Так, ко времени уборки, только 20% необработанных растений достигли фазы цветения, 55% находились в стадии бутонизации. У растений, обработанных ризоторфином, 95% растений вступили в генеративный этап развития.

Таким образом, штамм Rhizobium galegae 0716 существенно увеличивает продуктивность растений козлятника лекарственного, ускоряет их развитие, что указывает на то, что предлагаемый штамм является активным азотфиксирующим микросимбионтом козлятника лекарственного и может быть использован для получения бактериального удобрения под это растение.

Формула изобретения

Штамм бактерий Rhizobium galegae ВНИИСХМ N 0716 для получения удобрений под козлятник лекарственный.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2