Штамм бактерий erwinia sтеwаrтii для получения стимулятора роста растений

 

Использование: сельскохозяйственная микробиология, производство стимуляторов роста растений. Сущность изобретения: штамм бактерий Erwinia Stewartii TC-183 выделен из прикорневой зоны дикорастущих растений. Депонирован в коллекции ИБФМ АН СССР под номером ВКМ В-1888 D. Штамм выращивают на среде 925 с добавлением 100 мкг/мл триптофана, инкубируют трое суток 25-30°С. Штамм продуцирует вещества типа индолилуксусной кислоты (ИУК) в количестве 22-60 мкг/мл. Полученную культуральную жидкость разбавляют водой до концентрации 0,1 и 0,5 мкг/мл ИУК и исследуют влияние полученного стимулятора роста на рост корней табака, укоренение листовых черенков фасоли, рост саженцев винограда. Применение стимулятора роста способствует образованию корней у табака в 2-3 раза больше, чем в контроле, улучшению развития растений винограда на 22%. 3 табл,

союз советских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51) 5

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ

К ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) (21) 4945679/13 (22) 17.06.91 (46) 15,01.93, Бюл. N. 2 (71) Институт молекулярной генетики АН СССР (72) В.А.Липасова, Т,А.Сорокина и

И.А,Хмель (73) Институт молекулярной генетики PAH (56) Авторское свидетельство СССР

N -1218506,,А 01 N 63/00, 1986, Авторское свидетельство СССР

N.1642973, .кл. .А 01 N 63/00, 1991. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ERWI NI A

$ТЕЧЧАВТ!! ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУЛЯТОРА РОСТА РАСТЕНИЙ (57) Использование: сельскохозяйственная микробиология, п роизводртво стимуляторов роста растений. Сущность изобретения; штамм бактерий Erwinia Stewartii TC-183

Изобретение относится к области сельскохозяйственной микробиологии и касается штамма, который продуцирует ростактивирующие вещества, и может быть использован для стимуляции роста растений с целью повышения урожайности.

В сельскохозяйственном производстве используют s качестве регуляторов роста растений витамины, аминокислоты, органические кислоты, ауксины, в частности, индолилуксусную(ИУК), индолилмасляную(ИМК) кислоты и гибберелины, а также другие биологически активные вещества. Однако, недостатком многих из этих препаратов

„„!Ы „„1788952 АЗ выделен из прикорневой зоны дикорастущих растений. Депонирован в коллекции

ИБФМ АН СССР под номером ВКМ В-1888

D. Штамм выращивают на среде 925 с добавлением 100 мкг/мл триптофана, инкубируют трое суток 25-30 С. Штамм продуцирует вещества типа индолилуксусной кислоты (ИУК) в количестве 22 — 60 мкг/мл. Получен ную кул ьтурал ьную жидкость разбавляют водой до концентрации

0,1 и 0,5 мкг/мл ИУК и исследуют влияние полученного стимулятора роста на рост корней табака, укоренение листовых черенков фасоли, рост саженцев винограда. Применение стимулятора роста способствует образованию корней у табака в 2-3 раза больше, чем в контроле, улучшению развития растений винограда на 22,. 3 табл, является то, что они дороги, требуют специального производства и иногда вызывают нежелательный побочный эффект. Природный ауксин-ИУК-оказался не очень пригодным для практических целей из-за его относительной нестабильности и быстрого распада в организме растения, Что касается гибберелинов, то их стимулирующее действие очень специфично и зависит от вида растений, кроме того, они часто оказывают ингибирующее влияние на развитие корневой системы растений.

В последнее время больше внимания уделяется биологическим способам стиму1788952

10

25

40

50

55 ляции растений, менее вредным для здоровья человека и более безопасным в экологическом отношении. С этой целью используют разные микроорганизмы, продуцирующие ростактивирующие вещества.

Известен способ предпосевной обработки семян путем замачивания их в водной суспензии клеток Bacillus brevis в концентрации Зх10, с целью повышения всхожести семян и стимулирования развития растений, принятый за прототип.

Штамм Bacillus brevis не является представителем риэосферной микрофлоры и floэтому не конкурентноспособен в зоне корней растений.

Целью изобретения является выделение природного штамма — продуцента ðoñтактивирующих веществ, естественным местообитанием которого является корневая система растений, для дальнейшего использования его в сельском хозяйстве, Штамм Erwlnta stewartil ТС-183 был выделен из прикорневой зоны дикорастущих растений залежи некосимой Каменной степи Воронежской области в 1982г.

Штамм Erwinia stewartii TC-183 после депонирования во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ АН СССР имеет регистрационный номер BKM В-1888 D.

Штамм характеризуется следующими особенностями: Это неспорообраэующие, грамотрицательн ые, одиночные подвижные палочки, движутся при помощи перитрихальных жгутиков. Клетки хорошо растут на обычных питательных средах: мясо-лептонном агаре, агариэованном бульоне Хоттингера, картофельном агаре, минимальных средах с глюкозой. Морфология колоний определялась после роста 4-5 суток при 28 С.

Колонии на МПА серые, в проходящем свете голубые, почти плоские с более выпуклым центром, края гладкие, диаметр 3-5 мм. На

МПА с глицерином (2%) колонии белые слабо выпуклые с приподнятым центром, гладкие слизистые блестящие. На среде Кинга А — слабый желто-оранжевый пигмент, диффундирующий в среду: на среде Кинга Б— пигмент желтоватый, зеленый флюоресцирующий пигмент отсутствует, Факультативный анаэроб. Метаболизм глюкозы дыхательный и бродильный, с незначительным газообразованием, В дополнительных факторах роста не нуждается.

Оксадазной активностью не обладает. Желатину не разжижает. Индол не образует.

Обладает слабой уреаэной активностью.

Лизин-, аргинин-, орнитин-декарбоксилазы не образует. Фенилаланиндезаминазы не образует. Образует Р -галактозидазу. Утилизирует цитрат и малонат Na, Не образует кислоты из адонита, дульцита, инозита.

Усваивает с образованием кислоты: глюкозу,сахарозу,лактозу,мальтоэу, ксилозу, рамноэу, манноэу, арабиноэу, маннит и сорбит. Хорошо растет при температуре от

16 до 37 С, при 4 и 42 С не растет.

Штамм устойчив к следующим антибиотикам: ампициллину (200 мкг/мл), хлорамфениколу (10 мкг/мл), пенициллину (200 мкг/мл), и чувствителен к тетрациклину(1020 икгlмл), канамицину (50-200 мкг/мл), стрептомицину (50-200 мкг/мл), .

Штамм В КМ B-18888 D не фитотоксичен и не вирулентен для лабораторных животных.

Штамм хранится на косяках картофельного агара в холодильнике с пересевом на свежие косяки через 2-4 месяца и в лиофильно высушенном состоянии (в ампулах) не менее одного года. При лиофилизации клетки штамма выращивались на агариэованном бульоне Хоттингера в течение суток и смывались раствором для лиофилизации следующего состава: 1 мл физиологического раствора и 1 мл смеси (10 мл сыворотки крови крупного рогатого скота без консерванта+ 1 мл раствора сахарозы 30 г/30 мл), Штамм идентифицирован по определителю Bergy s manual of Systematic

Bacteriology" ч1„ed.Krteg МЛ., Holt J.ä.

Williams WiIkins, Baltimore / London, 1984.

Штамм Erwlnla Stewartil ВКМ В-1888 D подуцирует вещества стимуляторы роста растений типа гетероауксинов

Свойства заявляемого штамма иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Изучение способности штамма синтезировать вещества типа ауксинов, За основу была принята методика определения ростовых веществ типа ауксинов, описанная Таннером и Андерсоном (10). Испытуемую 1 — 2 суточную культуру, выращенную на среде "Кадо" засевали в 1,5 мл среды

925 (11) с добавлением 100 мкгlмл триптофана и инкубировали трое суток пи 25-30 С.

Затем отбирали по 150 мкл культуральной жидкости, добавляли 1/2 (75 мкл) реактива

Сальковского. При этом, если в среде присутствует ауксин, то через 30 мин при комнатной температуре должно появиться розовое окрашивание. По интенсивности окраски судят о количестве ауксина, Среди проверенных штаммов имеющейся в нашем распоряжении коллекции бактерий (около 300), обнаружены штаммы, обладающие способностью синтезировать вещества типа индолилуксусной кислоты

1788952

25

35 (ИУК). Наиболее активным продуцентом

ИУК был заявляемый штамм В-1888 О.

Кроме качественной реакции было определено количественное содержание ИУК в продуктах метаболизма штамма. Для этой цели была построена калибровочная кривая с разными концентрациями (5 — 50 мкг/мл, химически чистой ИУК. Определение велось по оптической плотности при длине волны

525 нм. Количество ИУК, синтеэируемое штаммом В-1888 D, по калибровочной кривой колебалось от 22 до 60 мкг/мл в зависимости от образца, Таким образом, штамм Erwinia stewartll

В-1888 D обладает способностью синтезировать вещества типа индолилуксусной кислоты, Пример 2, Изучение влияния продуктов метаболизма штамма В-1888 D на корнеобраэование растений.

Для этой цели готовили культуральную жидкость следующим образом. К клеточной суспенэии В-1888 D добавляли 1/10 объема хлороформа и встряхивали 15 мин при комнатной температуре. Затем центрифугировали, собирали надосадочную жидкость и встряхивали на качалке при 37 С в течение

15 — 20 мин. После этого делали необходимые разведения в стерильной воде.

Испытывали диапазон концентрации продуктов метаболизма, соответствующих по калибровочной кривой от 0,00001 до 0,5 с мкг/мл чистой ИУК. Контролем служили те же концентрации ИУК, а также среда 925 и вода. Результаты учитывали по скорости и мощности образования корней, В качестве объектов использовались листья табака и листья фасоли (12).

Результаты приведены в табл.1 и 2.

Продукты метаболизма штамма Erwlnia

stewartii В-1888 D стимулировали образование корней у обоих взятых для опыта растений. Если в воде и среде 925 укоренение наблюдалось только на 10-11 день, то в варианте с культурой корни появлялись на

7 день опыта и были более мощными по сравнению с контрольными растворами и с чистой ИУК, соответствующей концентрации.

Действие культуры на корнеобразование проявлялось в очень низких концентрациях (до 0,0001 мкг/Mll).

Пример 3. Изучение-влияния штамма

В-1888 D на рост растений-саженцев винограда.

Для выяснения влияния живых клеток культуры штамма B-1888 D на рост растений был поставлен опыт с саженцами винограда в производственных условиях — в совхозе

Краснодарского края. Неодревесневшие черенки винограда сорта "Памяти Негруля" нарезали на 2 — глазковые черенки. Нижние срезы черенков помещали в емкость с суспензией штамма  — 1888 D на 3 — 4 часа, Контрольные варианты помещали в емкости с водой на то же время, Затем черенки размещали в установке для зеленого черенкования, где в условиях температуры 25-26 С и постоянного туманообразования они находились в течение 25 — 30 дней, За этот период формируются корни и трогается в рост верхний глазок (почка). После этого черенки переносили в почву, где они росли втечение вегетационного периода.

Результат опыта приведен в табл.3, Полученные данные показывают, что предпосевное замачивание черенков винограда в суспензии бактерий штамма В-1888

D способствует улучшению развития растений, что проявляется в величине вызревшего прироста, превышающего этот показатель в контроле на 22, Таким образом, заявленный штамм

Erwlnla stewartil В-1888 D относится к группе эпифитных бактерий, развитие которых тесно связано с высшим растением и явля40 ется продуцентом веществ типа гетероауксинов. Он может быть использован в сельскохозяйственной практике для стимулирования корнеобраэования и роста растений, Формула изобретения

Штамм бактерий Erwinta stewartii ВКМ

В-1888 D для получения стимулятора роста растений.

1788952

Таблица 1

Влияние продуктов метаболизма В-1888 D на образование корней у табака.

Примечание: - отсутствие корней

+ образование корней / оценка по 5-бальной системе/

* корни утолщенные

Таблица 3

Влияние водной суспензии клеток штамма В-1888 0 на рост саженцев винограда.

Составитель В.Липасова

Техред М.Моргентал Корректор 3.Лончакова

Редактор

Заказ 82 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Таблица 2

Влияние продуктов метаболизма В-1888 D на укоренение листовых черенков фасоли.