Способ приготовления иммуносорбента для диагностики цитомегаловирусной инфекции

 

Изобретение относится к медицине и касается диагностики цитомегаловирусной /ЦМВ/ инфекции. Целью изобретения является разработка способа приготовления иммуносорбента для диагностики "текущей" ЦМВ инфекции с помошью иммуноферментного анализа /ИФА/. Поставленная цель достигается тем, что ионослой клеточных культур заражают ЦМВ, инкубируют вирус 48-72 ч, затем из вирусинфицированных клеток выделяют ядерную фракцию, содержащую "ранние" белки ЦМВ, которую используют в качестве антигена для приготовления иммуносорбента на полистироловых 96-луночных пластинах. 2 табл.

Изобретение относится к медицине и касается диагностики цитомегаловирусной (ЦМВ) инфекции, что имеет большое значение.

Известно, что ЦМВ - представитель герпесовирусов - способен вызывать как острое, так и латентное заболевание. У 80% людей первичное инфицирование вирусом происходит в первые 2-3 года жизни, при этом в 95% случаев отсутствуют какие-либо клинические симптомы. Однако перенесенная инфекция сопровождается выработкой вирусспецифических антител, которые сохраняются в течение практически всей жизни человека (т.н. "анамнестические" антитела). В период латентного состояния ЦМВ-инфекции выделение вируса во внешнюю среду не происходит, но гуморальные "анамнестические" антитела могут определяться в различных серологических реакциях.

При нарушении иммунного статуса ранее инфицированного ЦМВ человека вирус начинает активно реплицироваться, и его можно обнаружить в различных биологических жидкостях (крови, моче, слюне и др.). В ответ на репликацию вируса в организме начинают синтезироваться специфические антитела к так называемым "ранним" вирусным белкам (белкам, нарабатывающимся в течение 24-72 ч после инфицирования ЦМВ или его реактивации) (Landini, Michelson, 1988). Обнаружение антител к "ранним" белкам свидетельствует о "текущей" в данный момент инфекции и имеет важное значение для правильного введения больных с врожденными и приобретенными иммунодефицитами (СПИД, внутриутробная инфекция, трансплантация органов).

Для диагностики ЦМВ-инфекции используется вирусологический метод выделения возбудителя в чувствительной культуре клеток с последующей идентификацией выделенного изолята методом иммунофлюоресценции с моноклональными антителами (Drew, 1988; Swenson, Kaplan, 1987; Gleaves et al., 1984). Недостаток этого метода является его длительность (подтверждение диагноза можно получить только на 20-30 день после взятия образца крови или мочи у заболевшего) и его трудоемкость.

Серологическая диагностика при ЦМВ-инфекции имеет ограниченное применение, так как ввиду латентного характера ее течения факт обнаружения антител не свидетельствует о текущей инфекции. Даже использование различных методов, основанных на выявлении вирусспецифических иммуноглобулинов класса М, в случае рецидивирующей инфекции не обеспечивает получения достоверных результатов, ибо рецидив не во всех случаях сопровождается образованием антител этого класса (Doers еt al., 1985).

Наиболее близким к предлагаемому методу является выявление антител к ЦМВ в сыворотках людей в иммуноферментном анализе (Аbbott СMV total АA ЕIА). Иммуносорбентом в таких тест-системах являются антигены, выделенные из инфицированных культур клеток на высоте развития цитопатического эффекта.

Недостатком указанного метода является невозможность проведения диагностики ЦMВ-инфекции, так как эта тест-система не позволяет дифференцировать "анамнестические" антитела от синтезируемых в данный период времени антител, нарабатывающихся в ответ на заражение вирусом или реактивацию латентного вируса.

Целью данного изобретения является разработка способа приготовления иммуносорбента для диагностики "текущей" инфекции ЦМВ c помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Поставленная цель достигается тем, что из ядерной фракции клеток, инфицированных ЦМВ, через 48-72 ч после их инфицирования выделяют вирусспецифические "ранние" белки, которые адсорбируют в лунках 96-луночных полистироловых пластин.

П р и м е р 1. Заражают перевиваемую линию клеток фибробластов эмбриона человека цитомегаловирусом, штамм АD-169, который был получен из Американской коллекции вирусов и в настоящее время поддерживается в лаборатории диагностики вирусных инфекций НИИ вирусных препаратов Российской АМН СССР. Через 48-72 ч после заражения проводят выделение ядерной фракции клеток. Для этого инфицированные вирусом клетки отделяют от стекла раствором трипсина и однократно промывают фосфатно-буферным раствором рН 7.4 (ФСБ). Осадок клеток, разведенный в дважды дистиллированной воде, содержащей 2% фетальной телячьей сыворотки, инкубируют в течение 15 минут в ледяной бане. Затем добавляют равный объем 1% раствора неионного детергента (NP-40) и полученную смесь гомогенизируют в гомогенизаторе Даунса. Ядра отделяют от цитоплазматических осколков центрифугированием через 22,5% раствор Ficoll 400, приготовленного на ФСБ, рН 7,4, при 1800 g в течение 15 мин при 4^oС. Осадок однократно промывают ФСБ, рН 7,4, ресуспендируют в том же буфере и обрабатывают ультразвуком (три цикла по 30 с с интервалом между циклами в 1 мин.). Полученный "ядерный" антиген, содержащий ранние белки ЦМВ, осветляют центрифугированием при 8000 g в течение 20 мин.

Для получения иммуносорбента в лунки нечетных рядов (А, С, Е, G) полистироловых 96-луночных микротитровальных пластин вносят по 100 мкл (0,1 мл. ) вирусного антигена, в концентрации не менее 1 мкг на лунку. В лунки четных рядов (B,D,G,H) вносят по 100 мкл контрольного антигена, выделенного из незараженной культуры клеток тем же способом, что и вирусный антиген.

Пластины, закрытые крышками, инкубируют при 4-10^oС в течение 18-20 ч. После 3-кратного промывания дистиллированной водой, содержащей 2% твина-20, пластины с нагруженными антигенами хранят при 4-10^oC до использования. Срок хранения иммуносорбента - 6 мес.

П р и м е р 2. Для получения препарата "ранних" белков используют ту же культуру клеток, что описана в примере 1, инфицированную штаммом "Дов-90", выделенным из мочи больного ЦМВ-инфекцией. Штамм "Дов-90" хранятся в музее НИИ вирусных препаратов. Все этапы приготовления иммуносорбента и его контроля проводят в соответствии с описанным в примере 1.

П р и м е р 3. Для приготовления твердофазного иммуносорбента культуру диплоидных клеток легкого эмбриона человека заражают штаммом ЦMВ AD-169. Культура клеток депонирована в коллекции клеточных культур Государственного НИИ контроля и стандартизации медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича. Все процедуры получения и контроля иммуносорбента проводят аналогично тому, как описано в примере 1.

П р и м е р 4. Для приготовления препарата "ранних" белков ЦМВ с целью его использования для получения иммуносорбента культуру диплоидных клеток, описанную в примере 3, заряжают ЦМВ, штамм "Дов". Остальные процедуры приготовления и контроля иммуносорбента проводят как описано в примере 1.

П р и м е р 5. Исследование сывороток в ИФА проводят по ранее описанному методу (Voller et al., 1979) с использованием антител против иммуноглобулинов человека, меченных пероксидазой. Каждую сыворотку исследуют в разведении 1:100 как с вирусным, так и с контрольным антигенами. В результате проведенных исследований была установлена пороговая величина оптической плотности (ОП) при реакции антител с вирусным и контрольным антигенами, разграничивающая положительные и отрицательные сыворотки, которая составила 0,2 оптические единицы. Если разность оптических плотностей (АOП) при реакции сыворотки с вырусным и контрольным антигенами больше 0,2 О.Е., то сыворотка расценивается как положительная, т.е. содержащая антитела к "ранним" белкам ЦМВ.

Приведенные примеры приготовления иммуносорбента с использованием различных штаммов ЦМВ и разных типов клеток, в которых этот вирус способен размножаться, а также результаты исследования на сконструированных иммуносорбентах панели сывороток, содержащих и не содержащих антител к "ранним" белкам ЦМВ свидетельствуют о возможности использования любого доступного штамма ЦМВ, активно размножающегося в подходящей линии культуры клеток. Это является доказательством промышленной применимости предлагаемого способа приготовления иммуносорбента для быстрой диагностики ЦМВ-инфекции в ИФА тест-системе для выявления антител к ЦМВ.

Было обследовано 56 лиц, в сыворотках которых на прототипной тест-системе были выявлены антитела к ЦМВ. Из этой группы обследованных у 31 пациента с клинически выраженным заболеванием (пневмония, спленомегалия, гепатит и др. ) цитомегаловирусная инфекция была подтверждена выделением вируса из мочи или гистологическим по обнаружению в моче "гигантских" клеток. 25 доноров на момент обследования были практически здоровы.

Результаты исследования сывороток на разработанной тест-системе сравнительно с прототипом представлены в табл.2.

Приведенные данные показывают, что в ИФА тест-системе фирмы "Аbbott" невозможно дифференцировать "анамнестические" антитела от антител, синтезированных в ответ на протекающую в данный момент инфекцию. С помощью предлагаемого иммуносорбента антитела к "ранним" белкам были выявлены только в группе больных с подтвержденной другими методами ЦМВ-инфекцией.

Полученные результаты свидетельствуют об эффективности предлагаемого способа получения иммуносорбента для ранней и быстрой диагностики ЦМВ-инфекции.

С использованием иммуносорбента, приготовленного разработанным способом, к настоящему времени обследовано более 300 сывороток от больных людей с подозрением на ЦМВ-инфекцию. В 36 случаях, подтвержденных также выделением вируса на чувствительной культуре клеток, были выявлены антитела к "ранним" белкам ЦМВ.

Было зарегистрировано 100% совпадение результатов вирусологического и серологического обследования.

Формула изобретения

СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ИММУНОСОРБЕНТА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ, отличающийся тем, что, с целью диагностики "текущей" цитомегаловирусной инфекции, клеточные монослойные культуры инфицируют цитомегаловирусом, через 48 - 72 ч после их заражения выделяют вирусоспецифические белки из ядерных фракций инфицированных клеток и используют их для сорбции в лунках полистироловых 96-луночных пластин в качестве целевого продукта.

РИСУНКИ

Рисунок 1