Способ получения основы питательных сред для культивирования микроорганизмов

 

Использование: в микробиологии, ветеринарии, медицине при получении питательных сред для культивирования микроорганизмов. Сущность изобретения: для получения основы питательных сред ведут гидролиз животного сырья препаратом коллагеназы из гепатопанкреаса промыслового краба при pH 7,0 - 9,5 и температуре 40 - 50°С в течение 3 - 6 ч. 3 табл.

Изобретение относится к медицинской биотехнологии, получаемые по данному способу основы могут быть использованы в микробиологии, ветеринарии, медицине и т.п.

Известны способы приготовления основ питательных сред для культивирования микроорганизмов путем ферментативного гидролиза животного сырья, например с помощью щелочных протеаз, таких как трипсин и папаин (см. "The Oxoid Manual of Culture Media Ingredients and Other Laboratory Services", Hampshire, 1982. Liver Digest Neutralised, code L27, p. 239; Tryptose, code L47, p. 244; Peptone Bacteriological, code L37 p. 240). В результате использования этих ферментов получают высококачественные основы питательных сред с высокой коммерческой ценностью.

Однако использование в больших количествах остродефицитных протеаз сильно ограничивает возможности использования этих способов. Так, из-за отсутствия сырьевой базы в нашей стране такой препарат, как папаин не производится вовсе, а другая щелочная протеаза - трипсин, является дорогостоящим препаратом медицинского назначения и производится в недостаточных количествах.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является получение перевара Хоттингера - основы широкого спектра бактериологических питательных сред, путем ферментативного гидролиза животного сырья с помощью панкреатина, содержащегося в поджелудочной железе крупного рогатого скота (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. Под ред. Биргера М.О. М.: Медицина, 1982.

По этому способу мясо, очищенное от жира и сухожилий, нарезают кусками примерно 1-2 см, опускают небольшими порциями в емкость с двойным количеством (по отношению к мясу) кипящей водопроводной воды и кипятят 45 мин. Мясо вынимают из бульона и пропускают через мясорубку. В бульоне устанавливают рН 8,0, опускают туда фарш, охлаждают до 40^оС, затем добавляют измельченную поджелудочную железу или сухой панкреатин. После установления рН 7,8-8,0 смесь переносят в бутыль с плотной резиновой пробкой, добавляют хлороформ, несколько раз перемешивают и оставляют на 7-16 дн при комнатной температуре.

В результате получают жидкий гидролизат с содержанием 1,1-1,2% общего азота, 0,65-0,7% аминного азота, степень расщепления 55-60%.

Недостатком данного способа является большая длительность процесса, а также использование в больших количествах остродефицитного дорогостоящего препарата медицинского назначения - панкреатина.

Целью изобретения является получение основ питательных сред без снижения их качества с помощью щелочных протеаз, выделенных из нового сырьевого источника.

Поставленная цель достигается тем, что измельченное животное сырье подвергают ферментативному гидролизу при рН 7,0-9,5 в течение 3-6 ч при 40-50^оС в присутствии препарата - коллагеназы из гепатопанкреаса промысловых крабов, с последующим высушиванием гидролизата.

Коллагеназа представляет собой комплекс протеолитических ферментов, выделенных из гепатопанкреаса промысловых крабов, катализирующих расщепление внутримолекулярных связей органических веществ, в том числе и белков (Sakharov I. , Litvin F.: Comp. Biochem. Physiol., 1990, v. 97B, p. 407-410).

Получаемый целевой продукт отвечает требованиям, предъявляемым к качеству аналогичных препаратов как по физико-химическим, так и биологическим характеристикам.

Приведенные выше технологические параметры обусловлены специфическими свойствами коллагеназы промысловых крабов, подобраны экспериментальным путем и являются оптимальными. В частности, проведение процесса ферментативного гидролиза при температуре выше 50^оС неосуществимо из-за инактивации фермента, а снижение рабочей температуры ниже 40^оС приводит к увеличению длительности процесса до 2 нед.

В предлагаемом способе удается сократить длительность процесса гидролиза до 3-6 ч вместо 7-16 сут по способу-прототипу и заменить остродефицитные щелочные протеазы доступным ферментным препаратом, имеющим в нашей стране крупномасштабную сырьевую базу. Кроме того, используемый в предлагаемом способе ферментный препарат - коллагеназу промысловых крабов, получают из неутилизируемых отходов пищевой промышленности, что повышает рентабельность отрасли.

Изобретение соответствует критерию "существенные отличия", так как не обнаружены известные технические решения, имеющие признаки, сходные с отличительными признаками указанного способа.

П р и м е р 1. 1 кг мясокостного фарша гренландского тюленя заливают водой, нагревают до 45-50^оС, устанавливают рН 7,5, добавляют коллагеназу краба из расчета 450-900 ЕД/кг сырья и проводят гидролиз в течение 6 ч. По окончании гидролиза из жидкого ферментативного гидролизата удаляют балластные белки, фильтруют, определяют физико-химические показатели качества и высушивают на распылительной сушильной установке.

Жидкий ферментативный гидролизат, полученный по предлагаемому способу, содержит 0,6-0,7% аминного азота, 1,1-1,4% общего азота, степень расщепления до 60%.

П р и м е р 2. 1 кг мясного фарша крупного рогатого скота заливают водой, нагревают до 45-50^оС, устанавливают рН 8,0, добавляют коллагеназу краба из расчета 450-900 ЕД/кг сырья и проводят гидролиз в течение 6 ч. По окончании гидролиза из жидкого ферментативного гидролизата удаляют балластные белки, фильтруют, определяют физико-химические показатели качества и высушивают на распылительной сушильной установке.

Жидкий ферментативный гидролизат, полученный по предлагаемому способу, содержит 0,5-0,7% аминного азота, 1,1-1,4% общего азота, степень расщепления до 60%.

П р и м е р 3. 1 кг мясокостного фарша гренландского тюленя заливают водой, нагревают до 40-45^оС, устанавливают рН 9,5, добавляют коллагеназу краба из расчета 450-900 ЕД/кг сырья и проводят гидролиз в течение 4 ч. По окончании гидролиза из жидкого ферментативного гидролизата удаляют балластные белки, фильтруют, определяют физико-химические показатели качества и высушивают на распылительной сушильной установке.

Жидкий ферментативный гидролизат, полученный по предлагаемому способу, содержит 0,6-0,7% аминного азота, 0,9-1,2% общего азота, степень расщепления до 65%.

П р и м е р 4. 1 кг мясного фарша крупного рогатого скота заливают водой, нагревают до 40-45^оС, устанавливают рН 8,5, добавляют коллагеназу краба из расчета 450-900 ЕД/кг сырья и проводят гидролиз в течение 3 ч. По окончании гидролиза из жидкого ферментативного гидролизата удаляют балластные белки, фильтруют, определяют физико-химические показатели качества и высушивают на распылительной сушильной установке.

Жидкий ферментативный гидролизат, полученный по предлагаемому способу, содержит 0,4-0,7% аминного азота, 0,9-1,2% общего азота, степень расщепления до 65%.

П р и м е р 5. Способ осуществляют как описано в примере 1, но гидролиз проводят в течение 2,5 ч.

Жидкий ферментативный гидролизат, полученный по предлагаемому способу, содержит 0,2-0,3% аминного азота, 0,7-0,9% общего азота, что свидетельствует о недостаточном расщеплении исходного сырья.

П р и м е р 6. Способ осуществляют как описано в примере 1, но гидролиз проводят в течение 6,5 ч.

Жидкий ферментативный гидролизат, полученный по предлагаемому способу, содержит 0,6-0,7% аминного азота, 1,1-1,4% общего азота, степень расщепления до 60% . Такие же показатели качества были получены при проведении гидролиза в течение 3-6 ч, т.е. увеличение времени гидролиза свыше этого срока нецелесообразно.

Для оценки основ питательных сред, полученных по предлагаемой технологии, по биологическим показателям они были использованы для приготовления бактериологических питательных сред. Контроль качества жидких и плотных питательных сред с этими основами проводился в соответствии с "Методическими рекомендациями к контролю питательных сред по биологическим показателям" Минздрава СССР. - М.: 1980 г., и включал следующие тесты: чувствительность роста; эффективность роста; показатель стабильности основных свойств микроорганизмов.

В работе использованы тест-штаммы грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, полученные из ГИСК им. Л.А.Тарасевича: Corynebacterium xerosis 1911; Streptococcus pyogenes Dick 1; Shigella flexneri 1a N 8516; Salmonella typhi H 901 ГДР/ГИСК; Shigella sonney "S form"; Staphylococcus aureus 209p; Escherichia coli.

В качестве контроля были использованы среды на основе ферментативного гидролизата Хоттингера производства Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи.

Чувствительность жидких и плотных питательных сред в отношении тест-штаммов микроорганизмов приведена в табл. 1 и 2.

Как видно из приведенных данных, жидкие и плотные среды с использованием основ, полученных по предлагаемому способу, в отношении большинства испытанных тест-штаммов микроорганизмов более чувствительным (5 штаммов из 7 испытанных), а в отношении Salm. typhi и Sh. Sonney не уступают по чувствительности при сравнении с контрольной средой. Эта разница прослеживается более четко на жидких средах с предлагаемыми основами, чувствительность которых в отношении испытанных тест-штаммов микроорганизмов на порядок выше, чем контрольной среды.

Более детальное изучение плотных сред с основами, приготовленными по предлагаемой технологии, в отношении тест-штаммов Грам микроорганизмов показано (табл. 3), что при посевной дозе 100 микробных тел на экспериментальных средах вырастает такое же или большее количество колоний, чем на контрольной среде.

Колонии тест-штаммов микроорганизмов, вырастающие на экспериментальных средах, не уступают по размерам колониям, выраставшим на контрольной среде с гидролизатом Хоттингера.

Культуры тест-штаммов, полученные на экспериментальных средах, были испытаны на сохранение основных культуральных, тинкториальных, морфологических и биохимических свойств, характерных для данного вида. Все испытанные тест-штаммы сохраняли свои культуральные, тинкториальные морфологические и биохимические свойства.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОСНОВЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ путем гидролиза животного сырья под действием протеолитического фермента, отличающийся тем, что в качестве протеолитического фермента используют препарат коллагеназы из гепатопанкреаса промыслового краба, причем гидролиз проводят при 40 - 50^oС и рН 7,0 - 9,5 в течение 3 - 6 ч.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2