Способ выращивания метанокисляющих микроорганизмов

 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа выращивания метанокисляющих микроорганизмов на питательных средах с использованием метана в качестве источника углерода. Для увеличения продуктивности процесса выращивания бактерий Methylococcus capsulatus процесс ведут при концентрации азота и фосфора в среде, регулируемой в зависимости от скорости протока согласно формулам: C_N= F/0,00165·V и C_P= F/0,00295·V , где C_N и C_P - концентрации азота и фосфора в питательной среде, г/л; F - скорость протока, м³/ч ; V - рабочий объем ферментера.

Изобретение относится к технической микробиологии, а именно к способам выращивания метанокисляющих микроорганизмов, и может быть использовано для промышленного производства белково-витаминного концентрата из природного газа.

Известен способ культивирования метанокисляющих микроорганизмов, согласно которому в процессе культивирования микроорганизмов в условиях аэрации на водной минеральной питательной среде, содержащей источники азота, фосфора и других макро- и микроэлементов, а также метан в качестве источника углерода, в культуральной среде поддерживают концентрацию фосфора на уровне 20-60 мг/л, а отношение концентраций калия, магния, железа, меди, марганца и цинка к концентрации фосфора соответственно на уровне 1:2, 1:4, 1:40, 1:60, 1:80 и 1:100.

Согласно известному способу процесс культивирования ведут, используя в качестве источника азотного питания аммиачную воду, которая одновременно служит регулятором величины рН, численное значение которой поддерживают на уровне 5,0-6,0 ед. Однако в зависимости от величины рН культивирования в указанных пределах содержание аммонийного азота в аппарате для выращивания микроорганизмов будет варьироваться в очень широких пределах. При этом понижение или превышение содержания азота в среде культивирования против оптимального неуклонно приведет соответственно к азотному голоданию или ингибированию процесса культивирования избытком азота и в обоих случаях к снижению продуктивности.

Известен также способ выращивания метанокисляющих микроорганизмов, по которому поддерживают концентрацию, например, азота, на уровне 80-200 мг/л путем регулирования различных технологических параметров. На неоптимальность содержания азота в среде культивирования, выраженного указанным пределом (80-200 мг/л), свидетельствует большой разброс получаемых при этом результатов. Кроме того, продуктивность процесса культивирования зависит не только от содержания азота, но и других источников питания и, в первую очередь, от оптимального содержания в среде фосфора.

Целью настоящего изобретения является увеличение продуктивности процесса путем поддержания в культуральной среде оптимальных концентраций азота и фосфора.

Цель достигается тем, что в способе выращивания метанокисляющих микроорганизмов в ферментере, предусматривающем непрерывное аэробное культивирование метанокисляющих бактерий, включающих Methylococcus capsulatus, на водной питательной среде, содержащей источник азота, фосфора, калия, магния и другие микроэлементы, а также метан в качестве источника углеродного питания, концентрации азота и фосфора в среде регулируют в зависимости от величины протока и объема ферментера согласно формулам C_N= C_p= н где C_N и С_р концентрации азота и фосфора в питательной среде, г/м³; F проток через ферментер, м³/ч; Y_p рабочий объем ферментера, м³; K_N 0,00165 м³/ч ˙ г азота удельный проток в расчете на 1 г азота в питательной среде; К_р 0,00295 м³/ч ˙ г фосфора удельный проток в расчете на 1 г фосфора в питательной среде.

Как видно из приведенных формул, в ферментерах с одним и тем же рабочим объемом концентрации азота и фосфора, а следовательно и остальных элементов минерального питания, для каждого значения протока через ферментер имеют строго определенные (оптимальные) значения. При этом с увеличением протока концентрации элементов минерального питания необходимо увеличивать, а с уменьшением протока снижать. Это можно объяснить тем, что с возрастанием протока уменьшается время пребывания биомассы в ферментере и для создания нормальных условий протекания биохимических процессов указанное уменьшение времени пребывания должно компенсироваться при прочих равных условиях изменением какого-либо другого параметра, в данном случае увеличение градиента концентрации через цитоплазматическую мембрану клетки, как движущей силы биохимического процесса, т.е. увеличением концентраций минерального питания в ферментере, и наоборот, с уменьшением протока уменьшением этих концентраций. Численные значения удельных протоков K_N и К_р находят экспериментальным путем из графика зависимости продуктивности от соотношений D/C_N и D/C_p (где D скорость протока, ч^-1) в виде значений указанных соотношений, отвечающих максимальной продуктивности процесса, осуществляемого в непрерывном строго стационарном режиме.

Выращивание метанокисляющих микроорганизмов Methylococcus capsulatus осуществляют в условиях аэрации с использованием природного газа в качестве источника углерода, а в качестве источника кислородного питания воздуха или смеси воздуха с кислородом. В качестве элементов минерального питания используют азот, фосфор, магний, калий, медь, железо, марганец, цинк, кобальт и другие микроэлементы преимущественно в виде сульфатов. Источником азотного питания служит аммиачная вода, являющаяся одновременно титрантом, автоматически поддерживающим рН культуральной среды на уровне 4,9-5,7 ед.

Давление в среде выращивания поддерживают в пределах 1-4 ати. Процесс культивирования проводят при 42-44^оС и скорости протока 0,15-0,35 ч^-1.

Сопоставительный анализ предложенного способа с прототипом позволил определить "Новые признаки": концентрации азота и фосфора в среде регулируют; концентрации азота и фосфора регулируют в зависимости от величины протока и объема ферментера.

Следовательно, предложенное техническое решение соответствует критерию "Новизна".

Аналогов, содержащих признаки, отличающие заявленное решение от прототипа, не обнаружено. Отличительные признаки заявленного решения не являются функционально самостоятельными, они не характеризуют часть способа, а следовательно, не могут быть проклассифицированы как самостоятельные объекты, т. е. их поиск отдельно от других частей объекта не производится. Заявленное решение соответствует критерию "Существенные отличия".

В качестве засевного материала использовалась полученная в производственных условиях культура метанокисляющих микроорганизмов Methylococcus capsulatus, штамм ВСБ-874 с сопутствующей микрофлорой. Однако, исходя из теоретических соображений, следует ожидать, что обнаруженная закономерность, составляющая сущность изобретения, будет соблюдаться при использовании и других штаммов указанного вида микроорганизмов.

П р и м е р 1. Выращивание метанокисляющей культуры вида Methylococcus capsulatus производили на водной минеральной питательной среде следующего состава (на 1 л раствора): Ортофосфорная кислота 0,5 мл Сернокислый калий 0,29 г Сульфат магния 0,20 г Сульфат марганца 19,0 мг Сульфат железа 21,0 мг Сульфат цинка 3,0 мг Сульфат меди 20,0 мг Сульфат кобальта 0,50 мг Молибдат натрия 0,50 мг Борная кислота 12,5 мг Источником азота и титрующим агентом служил 10%-ный водный раствор NH₄OH.

Предварительно экспериментальным путем были найдены значения констант К_р и K_N для приведенного выше состава водной минеральной среды, которые составили соответственно 0,00295 м³/ч ˙ г фосфора и 0,00165 м³/ч ˙ г азота. Выращивание осуществляли в ферментере струйного типа с рабочим объемом 1 м³ при 43^оС, давлении 2,5 ати, рН 5,4-5,7 ед. Расход природного газа и воздуха поддерживали соответственно на уровне 11 нм³/ч и 26,0 нм³/ч в расчете на 1 кг абсолютно сухой биомассы (АСБ).

Процесс непрерывного выращивания производили при протоке через ферментер, равном 250 л/ч. По приведенным выше формулам рассчитывали оптимальное содержание азота и фосфора в ферментере: C_N= 151 мг/л
C_p= 85 мг/л и поддерживали указанные концентрации на протяжении всего периода непрерывного выращивания. Постоянство концентраций фосфора и азота в аппарате осуществляли известными приемами, в частности, фосфора изменением концентрации минерального питания на входе в аппарат, а азота изменением задачи на автоматическое поддержание рН рабочей среды (поскольку повышение рН среды приводит к увеличению содержания азота, а понижение рН к снижению его содержания).

Продуктивность процесса непрерывного выращивания микроорганизмов составила 4,05 кг/м³ ˙ ч; в контрольном же опыте, проведенном при тех же условиях, но при поддержании концентрации фосфора в культуральной жидкости на уровне 50-100 мг/л и концентрации азота на уровне 100-150 мг/л продуктивность процесса составила 3,29 кг/м³ ˙ ч.

П р и м е р 2. Выращивание смешанной метанокисляющей культуры проводили в ферментере с рабочим объемом 320 м³ так, как описано в примере 1, но в качестве источника кислородного питания использовали смесь кислорода с воздухом с концентрацией кислорода 80% об. Расход источника кислородного питания и природного газа поддерживали соответственно на уровне 3,5 нм³/ч и 2,9 нм³/ч в расчете на 1 кг/ч абсолютно сухой биомассы. Непрерывное выращивание микроорганизмов при протоке, равном 70 м³/ч, осуществляли, поддерживая в ферментере концентрации азота и фосфора на заданном уровне известными приемами, причем заданный уровень находили из приведенных выше формул:
концентрации азота
C_N= 132,5 мг/л
концентрация фосфора
C_p= 74 мг/л
Продуктивность непрерывного выращивания составила 3,56 кг/м³ ˙ ч. В контрольном опыте, проведенном в тех же условиях при поддержании концентрации азота и фосфора в пределах 100-150 мг/л и 50-100 мг/л соответственно, продуктивность не превышает 2,9 кг/м³ ˙ ч.

П р и м е р 3. Смешанную метанокисляющую культуру выращивали в ферментере с рабочим объемом 30 м³, как описано в примере 2, при протоке, равном 5 м³/ч, и поддерживая концентрации азота и фосфора в культуральной жидкости постоянными и на уровне
C_N= 101 мг/л
C_p= 56 мг/л соответственно. При этом продуктивность процесса составила 3,4 кг/м³ ˙ ч, в то время как продуктивность в контрольном опыте, проведенном при концентрациях азота и фосфора в культуральной жидкости в пределах 100-150 мг/л и 50-100 мг/л соответственно, составила 2,8 кг/м³ ˙ ч.

Таким образом, выращивание метанокисляющих микроорганизмов в среде со строго определенными концентрациями азота и фосфора, зависящими от величины протока и объема ферментера, дает возможность увеличить продуктивность на 20-25%
Кроме того, удельные протоки по азоту K_N и фосфору К_р являются критериями масштабного перехода, пригодными для применения к ферментерам с различным рабочим объемом и не зависящими от рабочего объема.

Предлагаемый способ прост в осуществлении и позволяет поддеpживать оптимальные концентрации азота и фосфора в культуральной жидкости, тем самым дает возможность не только увеличить продуктивность процесса, но и предотвратить непроизводительные расходы раствора минерального питания, а следовательно, и снизить себестоимость конечного продукта белково-витаминного концентрата.

Установление закономерности изменения оптимальных концентраций азота и фосфора в зависимости от объема ферментера и протока позволяет легко автоматизировать процесс непрерывного выращивания микроорганизмов и стабилизировать его на различных значениях продуктивности.

Формула изобретения

СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ МЕТАНОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ, включающий непрерывное аэробное культивирование культуры метанокислящих бактерий Methylococcus capsulatus на водной питательной среде, содержащей источники азота и фосфора, а также метан в качестве источника углерода, отличающийся тем, что концентрацию азота и фосфора в среде регулируют согласно зависимостям


где C_N и C_P концентрации азота и фосфора в питательной среде, г/м³;
F скорость протока, м³/ч;
V рабочий объем ферментера, м³.