Способ получения лидазы

 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, биотехнологии. Цель изобретения - создание экологически чистого производства, расширение сырьевой базы, повышение выхода и увеличение удельной активности конечного продукта при снижении себестоимости. Замороженную репродуктивную ткань (промысловых рыб, семейств Salmonidae, Gadidae, Carandidae, а также моржа, ларги, акибы, лахтака, морского котика, тюленя, нерпы) измельчают, экстрагируют в 1,5 - 2,0 объемах 0,1 уксусной кислоты в течение 4 ч при температуре 4 - 10°С, отделяют балластные вещества, проводят ультрафильтрацию до увеличения удельной активности гиалуронидазы в 1,5 - 12 раз по сравнению с сырьем, после чего концентрат стерильно фильтруют, разливают во флаконы из расчета 64 у.е. и сублимируют.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и может быть использовано в медицине для получения препарата, обладающего гиалуронидазной активностью.

Известен способ получения гиалуронидазы, имеющей широкий спектр применения в тех случаях, когда необходимо разрушить шалуроновую кислоту, из сырья, например пиявки Gaffaio luches. Полученный таким образом препарат может применяться для лечения глаукомы. Он стабилен при высоких температурах и экстремальных значениях рН. Недостаток способа заключается в отсутствии сырья (этого вида свободно живущих пиявок) на территории нашей страны.

Известен способ получения лидазы, согласно которому замороженные семенники половозрелых быков измельчают, измельченную массу дефрастируют, добавляют раствор 12%-ной уксусной кислоты из расчета 100 мл на 1 кг сырья. Автолиз проводят в течение 18-20 ч при рН 4,5-4,6, при температуре 39-40^оС, после чего жидкую фракцию отделяют, стерилизуют путем фильтрации через фильтр типа Зейтца. Профильтрованный лизат охлаждают до температуры 1-3^оС и вливают в 4 объема ацетона с той же температурой, отстаивают 3-5 ч на холоду и жидкий слой отделяют. Осадок гиалуронидазы растворяют в дистиллированной воде, охлажденной до 2-3^оС из расчета 300 мл на 1 л исходного лизата. Раствор передают на стерильную фильтрацию, разливают во флаконы, сушат сублимационной сушкой. Недостаток способа высокая температура экстракции, что в сочетании с высокой концентрацией кислоты приводит к высокому выходу в раствор балластных белков и как следствие низкий выход по удельной активности конечного продукта (на мг/белка).

Наиболее близким по техническому решению является способ получения лидазы, включающий измельчение семенников половозрелых быков, экстракцию в 1,5-2,0 объемах 0,1 н. уксусной кислоты в течение 4 ч при температуре 4-10^оС, фильтрование, осаждение сырца лидазы 99%-ным ацетоном из расчета 4 объема ацетона на 1 объем экстракта при температуре не выше 0^оС, перемешивание и отстаивание в течение не менее 4 ч при температуре не выше 5^оС, отделение осадка, растворение осадка в воде из расчета 200-250 мл на 1 кг исходного сырья, фильтрацию, переосаждение лидазы 99%-ным ацетоном из расчета 6 объемов ацетона на 1 объем фильтрата при температуре 0^оС, отстаивания в течение 4 ч при температуре не выше 5^оС, промывки 99%-ным ацетоном при температуре 0^оС, сушку, стерильный розлив во флаконы и сублимационную сушку конечного продукта. Недостатком этого способа является низкая активность исходного сырья 140000 у.е. в 1 кг, вследствие чего высокая себестоимость конечного продукта, большие затраты ацетона, вредность производства, низкий выход (по активности) конечного продукта.

Задача, решаемая изобретением расширение сырьевой базы, создание экологически чистого производства, снижение себестоимости, повышение выхода и увеличение удельной активности конечного продукта.

Сущность способа заключается в следующем: замороженную репродуктивную ткань (молоки рыб, гонады гребешка, яичники и семенники моржа, ларги и т.д.) измельчают, экстрагируют в 1,5-2,0 объемах 0,1 н. уксусной кислоты в течение 4 ч при температуре 4-10^оС, отделяют балластные вещества, проводят ультрафильтрацию до увеличения удельной активности гиалуронидазы в 1,5-12 раз по сравнению с сырьевым, после чего концентрат стерильно фильтруют, разливают во флаконы (ампулы) из расчета 64 у.е. на флакон, сублимируют.

П р и м е р 1. В качестве сырья берется репродуктивная ткань рыб. 1 кг мороженных молок кеты измельчают на волчке. К измельченным молокам добавляют 1,5 л 0,1 н. (0,06% ) раствора уксусной кислоты. Экстракцию проводят при постоянном перемешивании при температуре 8^оС в течение 4 ч. По окончании экстракции определяют активность гиалуронидазы для определения исходной активности сырья, которая равняется 32 у.е. Гомогенат для отделения балластных веществ фильтруют на нутч-фильтре через бязь. Фильтрат собирают в мерники. Полученный объем фильтрата равен 2,6 л. Фильтрат подвергают ультрафильтрации на волоконных фильтрах с диаметром пор 10-25 кД. Концентрат собирают в мерники (полученный объем 600 мл) и определяют активность гиалуронидазы (она равна 132 у.е.), затем стерильно фильтруют, разливают во флаконы из расчета 64 у.е. на флакон и сублимируют.

Таким образом, в предлагаемом способе исключены стадии производственного процесса, в которых используется ацетон; снижена себестоимость конечного продукта за счет использования более дешевого сырья с более высокой ферментативной активностью; выход по сравнению с прототипом увеличен в 3,5 раза (по прототипу и из 1 кг сырья получен выход 35.000 у.е. фермента, а из молок 118.000 у.е), а также увеличена удельная активность в 3,0 раза за счет использования нового вида сырья и введения ультрафильтрации вместо осаждения ацетоном.

П р и м е р 2. Все операции по получению гиалуронидазы такие же, как и в примере 1. В качестве сырья используют семенники половозрелых моржей, ферментативная активность которых равна 64 у.е. После ультрафильтрации получен продукт с активностью 250 у. е. Выход по сравнению с прототипом выше в 2 раза, по удельной активности в 4 раза.

П р и м е р 3. Все операции по получению гиалуронидазы, как в примере 1. В качестве сырья используют яичники тюленя с ферментативной активностью равной 128 у. е. Полученный после ультрафильтрации продукт имеет удельную активность 500 у.е. Выход по сравнению с прототипом увеличился в 1,5 раза, по удельной активности в 8 раз. Таким образом, предлагаемый способ позволяет решить проблему сырья для производства гиалуронидазы. Так как используются отходы от переработки промысловых рыб семейств Salmonidae, Gadidae, а также отходы от переработки морзверя: моржа, ларги, акибы, лахтака, морского котика, тюленя, нерпы, белухи, серого кита, кашалота. Предложенное изменение технологии позволяет создать экологически чистое производство, повысить выход и увеличить удельную активность конечного продукта.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИДАЗЫ из репродуктивной ткани животных, включающий очистку сырья, измельчение, экстракцию водным раствором кислоты, фильтрацию с последующей стерильной фильтрацией целевого продукта и его сушкой, отличающийся тем, что в качестве сырья используют репродуктивную ткань гидробионтов и морских млекопитающих, а после отделения балластных веществ экстракт подвергают ультрафильтрации и концентрируют его до увеличения удельной активности в 1,5 12,0 раз по сравнению с активностью в исходном сырье.