Способ получения питательной среды для выращивания бифидобактерий

 

Сущность изобретения: питательную среду для выращивания бифидобактерий получают путем смешивания "Питательной среды 199 жидкой, стерильной взятой за основу, с пептоном и лактозой: на 500 мл основы - 1 г пептона, 10 -15 г лактозы. В небольшом количестве указанной основы растворяют при нагревании пептон, добавляют лактозу, стерилизуют при 0,5 атм 30 мин и ставят на хранение, которое осуществляют при 6 - 8°С в течение 6 - 8 мес. Перед использованием приготовленную среду регенерируют на водяной бане при 100°С в течение 30 мин.

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в производстве бифидобактерий.

Известен способ получения питательной среды Блаурокка для выращивания бифидобактерий: к 1 л печеночного бульона добавляют пептон, лактозу, хлорид натрия, цистин, агар-агар, твин-80; рН среды 7,4. Среду разливают во флаконы по 50-100 мл и стерилизуют дробно при 100^оС три дня подряд по 45 мин. Перед употреблением среду регенерируют кипячением в течение 40-45 мин. Для приготовления печеночного бульона 500 г говяжьей печени кипятят в 1 л воды в течение 2 ч. После фильтрации количество отвара доводят до 1 л водой.

Недостатком способа является трудоемкость и продолжительность приготовления: для осуществления способа готовят печеночный бульон, растворяют в нем компоненты, разливают во флаконы, стерилизуют дробно не менее 3 сут [1] Известен способ приготовления гидролизатно-молочной среды на основе гидролизата обезжиренного молока. Способ осуществляется следующим образом: обезжиренное молоко (обрат) кипятят 2 мин, охлаждают до 45^оС, устанавливают рН= 8,0, 20%-ным раствором NaOH. Гидролиз проводят панкреатином (1 г/л) в течение суток при 40-45^оС с коррекцией рН до 7,0-8,0 20%-ным раствором NaOH. Через сутки рН доводят до 4,5 30%-ным раствором уксусной кислоты, гидролизат кипятят 15 мин, фильтруют. Готовый гидролизат хранят под хлороформом при 4-6^оС. Отстоявшийся гидролизат разводят водой, добавляют в него агар-агар, пептон, хлорид натрия, лактозу, цистин. Стерилизацию готовой среды проводят при 0,5 атм в течение 30 мин. рН готовой среды 7,2-7,4.

Недостаток способа в том, что для приготовления гидролизатно-молочной среды требуется не менее 2-3 сут. Кроме того, он сложен и трудоемок в приготовлении [2] Известен также способ приготовления питательной среды, заключающийся в следующем: в емкость с дистиллированной водой вносят пептон, сухой питательный бульон, экстракт кормовых дрожжей и агар-агар. Смесь нагревают до расплавления агара, после чего добавляют лактозу, цистин солянокислый и аминокровин. Устанавливают рН 7,4, разливают по 10 мл в бактериологические пробирки и стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин. Перед использованием среду регенерируют кипячением на водяной бане 30-40 мин.

Недостаток способа в его трудоемкости, длительности, так как при его осуществлении необходимо смешивание и растворение многих компонентов, установление рН до 7,4, расфасовка подготовленной среды в бактериологические пробирки [3] Предложенный способ приготовления питательной среды для выращивания бифидобактерий не имеет указанных недостатков и прост в приготовлении.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение снижение трудоемкости, упрощение и ускорение приготовления питательной среды. Поставленная задача решается заявленным способом получения питательной среды для выращивания бифидобактерий, заключающимся в обработке питательной среды, взятой за основу, путем добавления компонентов в весовых частях, нагревания, стерилизации и регенерации среды перед использованием.

В качестве основы питательной среды берут "Питательную среду 199 стерильную жидкую" Medium nutritivus 199, fluidum". Из флакона с питательной средой 199 "Medium nutritivus 199, fluidum (500 мл) нестерильно берут 40-50 мл раствора, добавляют 1 г пептона, нагревают до растворения и прибавляют 10-15 г лактозы. Приготовленный раствор вносят обратно во флакон с "Medium nutritivus 199, fluidum", стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин и ставят на хранение.

Таким образом, в основе решения указанной задачи смешивание 1 г пептона и 10 15 г лактозы с 500 мл "Питательной среды 199 стерильной жидкой" "Medium nutritivus 199, fluidum" с последующей стерилизацией и регенерацией раствора, что соответствует критерию изобретения "изобретательский уровень".

"Питательная среда 199 стерильная, жидкая " Medium nutritivus 199, fluidum официальная синтетическая питательная среда, которая содержит в растворенном в виде все вещества, необходимые для жизнедеятельности соматических клеток вне организма. Она содержит полный набор аминокислот, в том числе все незаменимые аминокислоты: аргинин, гистидин,лизин, триптофан, фенилаланин, метионин, треонин, лейцин, изолейцин, валин, серосодержащие аминокислоты: метионин, цистин, цистеин, компоненты нуклеиновых кислот, витамины, источники липоидов и другие вещества, т.е. органические вещества, являющиеся источниками азота, углерода, серы, пуриновых и пиримидиновых оснований, необходимых для построения клеток. рН готовой среды 7,2-7,4 (фармакопейная статья 42-94ВС-88).

Указанная среда производится специализированными предприятиями для культивирования клеток и реализуется через аптечную сеть. Среда расфасована во флаконы емкостью 500 мл.

Применение "Medium nutritivus 199, fluidum" в качестве основы является новым для достижения технического результата и, следовательно, соответствует критерию "новизна".

Компоненты смешивают в следующем соотношении: на 500 мл указанной среды добавляют 1 г пептона и 10-15 г лактозы.

Особенностью выращивания бифидобактерий является то, что они являются анаэробами и имеют сложные питательные потребности.

Учитывая ярко выраженную ауксотрофность бифидобактерий, к "Medium nutritivus 199, fluidum" добавляют лактозу и пептон. Сбраживание лактозы бифидобактериями идет в анаэробных условиях, поддерживает эти условия аскорбиновая кислота, являющаяся компонентом "Medium nutritivus 199, fluidum".

Таким образом, при добавлении в указанную среду пептона и лактозы она приобретает все компоненты, необходимые для выращивания бифидобактерий.

Применение "Medium nutritivus 199, fluidum", в которой в растворенном состоянии находятся компоненты, необходимые для выращивания бифидобактерий, дает возможность ускорить и упростить процесс приготовления питательной среды, снизить его трудоемкость.

В этом заключается технический результат, который получен при осуществлении способа.

Способ осуществляется следующим образом: из флакона емкостью 500 мл, не снимая упаковки, нестерильно шприцем берут 40-50 мл среды, помещают в соответствующую объему емкость, вносят 1 г пептона, смесь нагревают до растворения, добавляют 10-15 г лактозы, раствор тщательно перемешивают. Затем этим же шприцем среду с пептоном и лактозой вносят в тот же флакон с "Medium nutritivus 199, fluidum. Стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин, ставят на хранение, которое осуществляют при 6-8^оС в этих же флаконах под резиновыми пробками, фиксированными металлическими колпачками, в течение 6-8 мес.

Перед использованием среду регенерируют на водяной бане при 100^оС в течение 30 мин. Выращивание биомассы бифидобактерий осуществляют обычными методами (Гончарова Г. И. К методике культивирования Bacterium bifidum "Лабораторное дело". 1968, N 2, стр. 100-102. Регламент производства бифидумбактерина сухого N 214-81).

П р и м е р 1. Из флакона с "Medium nutritivus 199, fluidum" (500 мл), не снимая упаковки, нестерильно шприцем берут 40 мл среды, помещают в соответствующую объему емкость, вносят 1 г пептона, смесь нагревают до растворения, добавляют 10 г лактозы, перемешивают, этим же шприцем среду с добавками вносят в тот же флакон с "Medium nutritivus 199, fluidum". Стерилизацию проводят при 0,5 атм 30 мин. Хранят при 6-8^оС в течение 6-8 мес. Перед использованием среду регенерируют при 100^оС в течение 30 мин на водяной бане.

Количество жизнеспособных клеток бифидобактерий, выращенных на данной среде, составляет 10⁸ в 1 мл, на среде Блаурокка 10⁸-10⁹ в 1 мл, на гидролизатно-молочной среде 10⁷-10⁸ в 1 мл.

П р и м е р 2. Приготовление питательной среды для выращивания бифидобактерий осуществляют как в примере 1, при этом добавляют 1 г пептона и 15 г лактозы.

Количество жизнеспособных клеток бифидобактерий на указанной среде составляет 10⁸-10⁹ в 1 мл.

П р и м е р 3. Приготовление питательной среды для выращивания бифидобактерий осуществляют как в примере 1, при этом добавляют 1 г пептона и 8 г лактозы. Количество жизнеспособных клеток бифидобактерий составляет 10⁷-10⁸ в 1 мл.

П р и м е р 4. Приготовление питательной среды для выращивания бифидобактерий осуществляют как в примере 1, при этом добавляют 1 г пептона и 17 г лактозы. Количество жизнеспособных клеток бифидобактерий составляет 10⁸-10⁹ в 1 мл.

Таким образом, использование "Питательной среды 199 стерильной жидкой "Medium nutritivus 199, fluidum", добавление к ней двух компонентов пептона и лактозы упрощает и ускорят процесс приготовления питательной среды для выращивания бифидобактерий, снижает его трудоемкость.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ БИФИДОБАКТЕРИЙ, предусматривающий внесение в основу питательной среды пептона, нагревание его до растворения, добавление в полученный раствор лактозы, стерилизацию при 0,5 атм в течение 30 мин и регенерацию среды перед использованием кипячением на водяной бане в течение 30 40 мин, отличающийся тем, что в качестве основы среды используют "Питательную среду 199 стерильную жидкую", причем пептон в количестве 1 г растворяют в 40 50 мл основы питательной среды, лактозу в полученный раствор вносят в количестве 10 15 г, а перед стерилизацией приготовленный раствор и оставшиеся 460 450 мл основы питательной среды смешивают.