Фрагмент днк cfb, используемый для выявления энтеробактерий, обладающих фактором колонизации cfa 1

 

Использование: биотехнология, генная инженерия. Сущность: получение фрагмента ДНК из природной плазмиды Escherichia coli H 104407, который используется для выявления патогенных энтеробактерий, обладающих фактором колонизации CFA I. Размер фрагмента составляет 950 п. н. причем нуклеотиды 1 484 относятся к некодирующей части оперона CFA I, а нуклеотиды 485 950 - к кодирующей области гена с faB. Данный фрагмент применяется в качестве ДНК-зонда для выявления генов оперона CFA I и для индикации штаммов энтеробактерий, обладающих фактором колонизации CFA I. 1 табл.

Изобретение относится к медицинской микробиологии, генетической инженерии, биотехнологии и может быть использовано для обнаружения патогенных энтеробактерий, обладающих фактором колонизации CFA I, методом молекулярной гибридизации.

Известны рекомбинантные плазмиды, содержащие фрагменты генов оперона СFA I, но ДНК-зонды на фактор колонизации CFA I, аналогичные CFb-фрагменту при патентно-информационном поиске не выявлены.

Для получения CFb-фрагмента выделяют методом Birnboim, Dolly тотальную плазмидную ДНК штамма Escherichia coli H10407 (штамм из коллекции Государственного института стандартизации и контроля иммуно-биологических препаратов). Плазмидную ДНК гидролизуют эндонуклеазой рестрикции Pst I, полученные фрагменты воссоединяют с Pst I гидролизатом плазмиды pGEM4Z (коммерческим вектором фирмы Promega, США) с помощью ДНК-лигазы фага Т4, лигированной смесью трансформируют клетки лабораторного штамма Е.соli ТG I. Штаммы, содержащие рекомбинантную плазмиду с фрагментом ДНК оперона CFA I, отбирают по результатам гибридизации со специфическим олигонуклеотидным зондом СF I. Рекомбинантную плазмиду выделяют, гидролизуют эндонуклеазой Pst I, продукты гидролиза разделяют в агарозном геле. Фрагмент плазмидной ДНК с размером около 0,9-1 тысяч пар нуклеотидов извлекают из геля методом электроэлюации и очищают методом фенольной депротеинизации.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1.

1.1 Конструирование плазмиды pCFA 1-226-источника получения фрагмента CFb.

Синтез ДНК-зонда происходит в процессе репликации рекомбинантной плазмиды за счет репликона pGEM4Z.

1 мкг ДНК вектора pGEM4Z гидролизуют рестриктазой Pst I (1 ед. акт.) 1 ч при 37^оС в буфере VII следующего состава: 0,01 М трис pH 8,0; 0,006 М MgCl₂; 0,006 М меркаптоэтанол; 0.4 М NaCl. Полноту гидролиза контролируют электрофорезом аликвоты (1/10 части) реакционной смеси в 0,8%-ном агарозном геле.

3 мкг суммарной плазмидной ДНК штамма Е.соli Н10407 гидролизуют рестриктазой Рst I (3 ед акт) 1 ч при 37^оС в буфере VII.

Плазмидную ДНК (1 мкг) и суммарную плазмидную ДНК Е.соli Н1047 (3 мкг) лигируют в 30 мкл буфера (0,66 мМ трис-HCl pH 7,6; 50 мМ MgCl₂; 10 мМ АТФ; 50 мМ дитиотреитола; ДНК-лигаза 3-10 ед активности) в течение 15-18 ч при 12-14^оС. Реакцию лигирования контролируют электрофорезом в 0,8%-ном агарозном геле.

Лигазной смесью трансформируют штамм Е.сoli TG 1. Выбор штамма обусловлен тем, что в присутствии плазмиды pGEM4Z он способен синтезировать фермент β-галактoзидазу за счет комплементации дефектного хромосомного гена 5'-концевым фрагментом гена, находящегося на плазмиде. Эта способность штамма не проявляется в присутствии рекомбинантных плазмид со встроенным по Hind III сайту фрагментом ДНК, длина которого не кратна трем, из-за сдвига рамки считывания β-галактозидазы. Клоны с такими рекомбинантными плазмидами, не обладающие β-галактозидазной активностью, отбирают на индикаторной среде с хромогенным субстратом ХgaI по отсутствию голубой окраски.

После трансформации E. сoli TG 1 лигазной смесью культуру высевают на чашки с LB агаром, содержащим 200 мкг/мл ампициллина, 40 мкг/мл XgaI и 240 мкг/мл индуктора β-галактозидазы ИПТГ. Через 14-20 ч на чашках вырастают голубые и белые колонии трансформантов.

1.2. Отбор и анализ рекомбинантных клонов со специфическими последовательностями оперона СFA I.

Поиск клонов, несущих рекомбинантную плазмиду с Pst I фрагментом ДНК оперона CFA I размером 950 пар нуклеотидов, осуществляют по результатам гибридизации со специфическим олигонуклеотидным зондом CF I (данный олигонуклеотид выбран на основании результатов сиквенса фрагмента оперона CFA I). Для этого белые колонии транcформантов с помощью репликатора пересевают на капроновые фильтры, находящиеся на поверхности МПА в чашках Петри. Фильтры с выросшими колониями бактерий денатурируют в растворе 0,5 М NaOH, 1,5 М NaCl, нейтрализуют в растворе 0,5 М трис-HCl, 1,5, М NaCl pH 8,0, отмывают в растворе 2хSSC и отжигают в вакуумном шкафу при 80^оС и давлении -1 атмосфера. После этого фильтры гибридизуют с олигонуклеотидным зондом CF I, гомологичным первым 20 нуклеотидам кодирующей области гена cfa B. Последовательность зонда 5'-АТGAAATTTAAAAAAACTAT-3'. Зонд предварительно метился изотопом фосфора Р-32 с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4. Из штаммов, гибридизовавшихся с олигонуклеотидным зондом, выделяют методом Birnboim, Dolly плазмидную ДНК и проводят определение нуклеотидных последовательностей вставок методом Сэнгера в модификации Мак-Гро. Секвенирование Pst I фрагмента показало, что он представляет собой часть оперона CFA I, нуклеотиды с 1 по 484 относятся к некодирующей части оперона, нуклеотиды с 485 по 950 к кодирующей области гена cfaB.

П р и м е р 2. Использование CFb-фрагмента в качестве зонда для выявления ДНК оперона фактора колонизации CFA I и бактерий, продуцирующих фактор колонизации CFA I.

2.1. Получение радиоактивного зонда для выявления штаммов энтеробактерий, продуцирующих фактор колонизации CFA I.

Выделяют рекомбинантную плазмиду pCFA 1-226 методом Birnboim и Doly. Штамм Е. coli TG I с рекомбинантной плазмидой выращивают в колбе со 100 мл мясо-пептонного бульона с ампициллином в концентрации 200 мкг/мл на качалке при аэрации 200 об/мин, температуре 37^оС до концентрации 3˙10⁸ клеток в 1 мл (оптическая плотность 0,6 о.е.), добавляют хлорамфенекол до концентрации 170 мкг/мл и инкубируют еще 18-20 ч. Бактериальные клетки осаждают центрифугированием 6 тыс. об/мин 15 мин. Осадок промывают 10 мл 0,9% раствора NaCl, после чего переосаждение повторяют. Осадок ресуспендируют в 10 мл раствора 20 mM Tris HCl pH 8,0; 10 mM ЭДТА; 50 mM глюкоза, добавляют 10 мл раствора 0,2 N NaOH; 1% SDS и осторожно перемешивают 10-15 мин до полного лизиса бактериальной массы. К лизату добавляют 15 мл 5 М ацетата К (pH 4,8) перемешивают, переворачивая центрифужную пробирку (должен выпасть белый хлопьевидный осадок). Центрифужную пробирку помещают на 1 ч в лед, затем лизат центрифугируют 40 мин при 5-5,5 тыс. об/мин и температуре 4^оС. Супернатант отбирают в чистую центрифужную пробирку и добавляют к нему 2 объема 96% этилового спирта, перемешивают и сразу центрифугируют при 5-5,5 тыс. об/мин 15 мин. Спирт сливают (осторожно, чтобы не выпал осадок). Осадок растворяют в 10 мл 0,3 М ацетата Na pH 8,0, добавляют 2 объема 96%-ного этилового спирта, выдерживают 1 ч при 4^оС и центрифугируют при 5-5,5 тыс. об/мин. Спирт сливают, после испарения остатков спирта осадок растворяют в 3 мл бидистиллированной воды. Для удаления примесей РНК к раствору плазмидной ДНК добавляют СаСl₂ до конечной концентрации 50 mM и выдерживают во льду 1 ч (должен выпасть осадок), центрифугируют при 10 тыс, об/мин 10 мин. Супернатант отбирают, ДНК переосаждают добавлением ацетата калия (pH 4-8) до концентрации 0,1 М и 2 объемов 96% этилового спирта. Осадок ДНК растворяют в 3 мл буфера 0,1 М Tris HCl pH 8,0; 50 mM NaCl; 2,5 mM ЭДТА и добавляют равный объем фенола, насыщенного аналогичным буфером, перемешивают на миксере или вручную 10 мин и центрифугируют при 4^оС, 10 тыс. об/мин 5 мин. Верхнюю фракцию, содержащую плазмидную ДНК, отбирают в чистую центрифужную пробирку, ДНК переосаждают ацетатом К и 96%-ным этиловым спиртом, центрифугируют при 4^оС, 10 тыс. об/мин 5 мин, спирт сливают, осадок промывают 3 мл 96%-ного этилового спирта. Центрифугирование повторяют, спирт сливают, после испарения остатков спирта осадок растворяют в 5 мл 0,1 М ацетата К, добавляют 2-3 объема этилового спирта и выдерживают при (-20)^оС 1,5 ч. Пробирку с осадком плазмидной ДНК центрифугируют при 4^оС, 10 тыс. об/мин 5 мин, супернатант сливают. Осадок ДНК дважды по 5 мин промывают 5 мл 80%-ного этилового спирта и один раз 5 мл 96% этилового спирта (между промывками и после третьей промывки проводят центрифугирование), спирт сливают, осадок подсушивают до испарения спирта и растворяют 1 мл ТЕ-буфера или бидистиллированной воды.

Для выделения зонда 10 мкг плазмидной ДНК гидролизуют в объеме 100 мкл рестриктазой Pst I (20-40 ед акт) в буфере VII в течение 1 ч при 37^оС. Полноту гидролиза проверяют электрофорезом аликвоты 0,2 мкг рестрикционной смеси в 0,8% агарозном геле. Затем оставшуюся рестрикционную смесь разделяют электрофоретически в 0,8% агарозном геле. Извлечение из агарозного геля нужного фрагмента ДНК проводят электроэлюцией, для этого перед нужной полосой ДНК скальпелем вырезают в геле ванночку. Она должна быть на 2 мм больше длины и ширины полосы ДНК. Заполняют ванночку свежим электрофорезным буфером и продолжают электрофорез, через каждые 2-3 мин буфер из ванночки отбирают, заполняют ее свежим буфером. Электрофорез продолжают до тех пор, пока вся ДНК из геля не переместится в буфер. Элюат экстрагируют дважды насыщенным фенолом и по одному разу смесью 1х1 насыщенный фенол хлороформ и хлороформом (процедуры экстракции аналогичны экстракции насыщенным фенолом плазмидной ДНК, описанной выше). ДНК осаждают добавлением 2 объемов 96%-ного этилового спирта. Осадок растворяют в 200 бидистиллированной воды, добавляют 25 мкл 3 М ацетата Na, pH 5,2, и снова осаждают 2 объемами 96% этилового спирта. Осадок промывают 1 раз 70% этиловым спиртом, просушивают и растворяют в 100-200 мкл бидистилированной воды или ТЕ-буфера, pH 7,6.

Мечение зонда изотопом Р-32 проводят методом ник-трансляции. Для этого упаривают водно-спиртовый раствор 32 Р dNTP, содержащий 100 пмоль вещества в 1,5 мл микроцентрифужной пробирке. В пробирку добавляют раствор ДНК зонда, содержащий 1 мкг ДНК; 1 нмоль каждого из немеченных dNTP (1 мкл 1 мМ раствора); 5 мкл 10х кратного буфера для ник-трансляции состава 0,5 М трис-HCl, pH 7,2, 0,1 M Mg₂SO₄, 1 мМ дитиотрейтол и 500 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина, бидистиллированную воду из расчета, чтобы общий объем реакционной смеси после добавления всех компонентов составил 50 мкл; 0,5 мкл раствора ДНКазы 1 концентрации 0,1 мкг/мл (ДНКазу разводят 1х буфером для ник-трансляции, содержащим 50% глицерин). После этого реакционную смесь перемешивают, добавляют к ней 5 единиц активности ДНК-полимеразы 1 и перемешивание повторяют. Инкубируют при 16^оС 1 ч. Реакцию останавливают добавлением 2 мкл 0,5 М ЭДТА. Ник-транслированную ДНК отделяют от невключившейся метки на микроколонке с сефадексом G-50 medium обычной хроматографией. Радиоактивность разных фракций, полученных после хроматографии, измеряют на счетчике β-радиоактивности и определяют процент включившихся 32-Р dNTP.

2.2. Выявление с помощью CFb-фрагмента ДНК оперона CFA I и энтеробактерий, продуцирующих фактор колонизации CFA I.

В связи с тем, что в СНГ не имеется коммерческих тест-систем для выявления бактерий, обладающих фактором колонизации CFA I, основанных на ИФА или ДНК-зондах, результаты, полученные при гибридизации с созданным ДНК-зондом сравнивали с результатами, полученными при выявлении фактора адгезии методом Д-маннозорезистентной гемагглютинации. Данный метод не может рассматриваться как альтернатива методам, основанным на использовании ДНК-зондов или иммунодиагностикумам, поскольку он позволяет лишь косвенно судить о наличии адгезивной активности по способности бактерий агглютинировать эритроциты в присутствии Д-маннозы. Данный методом применим для изучения чистых культур, довольно трудоемок и не позволяет исследовать большое количество образцов.

CFb-фрагмент апробирован при изучении распространения оперона CFA I на коллекции штаммов энтеробактерий различных по видовой принадлежности и происхождению. Исследовано 148 штаммов.

18-ти часовые культуры исследуемых микроорганизмов в объеме 100 мкл вносят в лунки плашки репликатора и штампом делают реплики на круглые нитроцеллюлозные фильтры диаметром 80 мм, предварительно помещенные в чашки Петри на поверхность 2% мясо-пептонного агара. Чашки с фильтрами инкубируют при 37^оС в течение 16-18 ч. Бактериальные колонии на фильтре денатурируют, помещая фильтр в раствор 0,5 М NaOH, 1,5 M NaCl на 5 мин, для нейтрализации щелочи фильтр переносят в раствор 1,5 М NaCl, 0,5 M трис-HCl, pH 8,0 на 5 мин, после чего фильтр промывают в двукратном SSC (30 мМ цитрат Na; 0,3 M NaCl) 5 мин. Фильтры переносят на фильтровальную бумагу и просушивают при комнатной температуре, затем помещают между двумя листами сухой бумаги и прогревают 2 ч при 80^оС в вакуумной печи. Отожженные фильтры помещают в кювету с промывающим раствором 50 мМ трис-HCl, pH 8,0; 1 M NaCl; 1 мМ ЭДТА; 0,1% SDS и инкубируют 1-2 ч при 42^оС со слабым перемешиванием (количество промывающего раствора должно быть таким, чтобы фильтры свободно перемещались относительно друг друга и не слипались). Отмытые от остатков питательной среды и бактерий фильтры помещают по 1-2 шт в чистые полиэтиленовые пакеты, в каждый пакет добавляют по 2 мл раствора для предгибридизации состава 5х раствора Денхардта (0,5 г фикола, 0,5 г поливинилпирролидона, 0,5 г бычьего сывороточного альбумина на 500 мл воды); 6х SSC (90 мМ цитрат Na, 0,9 М NaCl) 0,1% SDS, 100 мкг/мл денатурированной высокомолекулярной эукариотической ДНК. Из пакетов удаляют воздух, пакеты герметизируются. Фильтры в пакетах инкубируют 4 ч при 68^оС. Из пакетов удаляют выдавливанием раствор для предгибридизации, добавляют по 1 мл свежего раствора для предгибридизации и денатурированную кипячением радиоактивную ДНК зонда (не менее 200 тыс. импульсов/мин на фильтр). Проводят удаление воздуха и герметизацию пакетов, фильтры в пакетах инкубируют при 68^оС 18 ч. После завершения гибридизации фильтры извлекают из пакетов, для удаления невключившейся радиоактивной метки фильтры промывают: 3-4 раза по 5-10 мин в буфере 2х SSC; 0,1% SDS при комнатной температуре и 2 раза по 1 ч в буфере 1х SSS; 0,1% SDS при 68^оС. Фильтры переносят на лист фильтровальной бумаги и высушивают при комнатной температуре. Фильтры заворачивают в лавсановую пленку и прикрепляют к одному из усиливающих экранов в рентгеновской кассете. В кассету закладывают рентгеновскую пленку и экспонируют ночь (при необходимости более продолжительное время) при (-70)^оС. После проявления высушенную пленку совмещают с фильтрами в кассете и определяют месторасположение положительных проб, давших засветку.

Результаты исследования энтеробактерий разных видов на наличие фактора колонизации CFA I приведены в таблице.

С помощью CFb-фрагмента оперон CFA I выявлен у семи штаммов Е. coli и не обнаружен у других видов энтеробактерий. Результаты согласуются с данными, полученными при использовании метода Д-маннозорезистентной гемагглютинации.

Результаты исследований показывают, что данный фрагмент может быть использован для выявления энтеробактерий, обладающих фактором патогенности адгезином CFA I. ДНК зонд CFb позволяет с высокой специфичностью и чувствительностью исследовать одновременно большое количество проб на наличие ДНК оперона CFA I. Изобретение может применяться для совершенствования схемы индикации патогенных энтеробактерий.

Формула изобретения

ФРАГМЕНТ ДНК CFb, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ, ОБЛАДАЮЩИХ ФАКТОРОМ КОЛОНИЗАЦИИ CFA 1, выделенный из природной плазмиды Escherichia coli штамма H 10407, имеющий размер 950 п.н. и следующую последовательность нуклеотидов, указанную в описании.

РИСУНКИ

Рисунок 1