Способ получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок

 

Использование: ветеринарная вирусология, а именно получение диагностических препаратов. Сущность изобретения, органы инфицированных алеутской болезнью норок (селезенки, почки, печень) гомогенизируют в буферной системе, содержащей детергенты, гомогенат обрабатывают ультразвуком. Для осаждения неразрушенных клеток гомогенат дважды центрифугируют. К супернатанту добавляют полиэтиленгликоль и смесь выдерживают в течение 4 ч при 4^oС. Осажденный антиген уплотняют центрифугированием, осадок растворяют в минимальном количестве буфера. Вирусный антиген из раствора осаждают ультрацентрифугированием при 300000 g в течение 2 ч. Полученный вирусный препарат очищают от сопутствующих белков гель-хроматографией на сефарозе 6В. Вирусный антиген обладает высокой антигенной активностью и специфичностью. 1 з. п. ф-лы.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, а именно к получению диагностических препаратов.

Известен способ получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок, основанный на экстракции комплексов вируса с антителами с последующим разрушением этих комплексов с помощью фреонов [1] Недостатком данного способа является снижение антигенной активности вирусного препарата при обработке комплексов фреонами и неполная очистка от сопутствующих белков, что значительно снижает специфичность и чувствительность определения в радиоиммунном анализе (РИА) [2] В качестве прототипа выбран способ получения антигена, включающий гомогенизацию селезенок больных алеутской болезнью норок в физиологическом растворе, содержащем антибиотики, обработку гомогената ультразвуком, низкоскоростное центрифугирование, воздействие детергентом тритоном Х-100, ультрацентрифугирование при 100000 g и дальнейшую доочистку антигена с помощью гель-фильтрации [3] Известный способ не обеспечивает достаточной степени очистки вирусного антигена от ферритина и других балластных тканевых белков, что снижает антигенную активность и специфичность препарата. Это ограничивает возможность применения данного антигена для диагностики алеутской болезни норок с помощью радиоиммунологического анализа.

Настоящее изобретение направлено на получение вирусного антигена, свободного от примесей ферритина и других тканевых белков, обладающего большей антигенной активностью и специфичностью.

Поставленная задача решена тем, что в способе получения вирусного антигена для серологической диагностики алеутской болезни норок, включающем гомогенизацию внутренних органов больных норок, проводят обработку гомогената ультразвуком, низкоскоростное центрифугирование, ультрацентрифугирование и гель-фильтрацию антигена, ткань гомогенизируют в буферной системе, содержащей детергенты, (рН 7,2), антиген осаждают, добавляя к обработанному ультразвуком гомогенату полиэтиленгликоль, а ультрацентрифугирование осуществляют при 300000 g в течение 2 ч. Доочистку антигена осуществляют на сефарозе 6В.

Отличительной особенностью заявляемого способа от прототипа является то, что выделение антигена проводят комплексом детергентов в буферной системе непосредственно из гомогената тканей норок, а не из супернатанта после осаждения остатков ткани, как в известном способе. Экспериментально показано, что это позволяет увеличить выход антигена в 1,5 раза по сравнению с выходом антигена по методике способа-прототипа. Кроме того, осаждение антигена полиэтиленгликолем упрощает методику очистки. Ультрацентрифугирование при 300000 g в течение двух часов и рехроматография на сефарозе 6В освобождает препарат от сопутствующих клеточных белков, что способствует высокой степени очистки получаемого антигена, а отсутствие ферритина в препарате позволяет избежать ошибок, связанных с определением антител к ферритину.

Выделенный вирус алеутской болезни норок иммунохимически идентичен промышленному антигену, так как кроличьи антитела к полученному вирусу реагируют с коммерческим препаратом антигена в РИОЭФ (реакции осмоиммуноэлектрофореза) и полосы преципитации этих антигенов сливаются.

Важной для диагностики алеутской болезни норок характеристикой очищенного антигена является его участие в конкуренции с меченым ¹²⁵ I-промышленным антигеном за связывание с ограниченным количеством антител. Меченый антиген был получен путем радиоактивного иодирования коммерческого антигена [2] Экспериментально показано, что использование меченого ¹²⁵ I-антигена, полученного на основе высокоочищенного вирусного препарата, выделенного заявляемым способом, позволяет повысить чувствительность и специфичность радиоиммунологических анализов, направленных на раннее выявление заболевания норок алеутской болезнью. Так с помощью РИА можно определить 5-10 нг/мл антигена алеутской болезни норок, полученного заявляемым способом, и только 40-50 нг/мл антигена, полученного известным способом. Связывание иодированного вируса, полученного заявленным способом, с сывороткой больных норок более специфично по сравнению со связыванием иодированного вируса, выделенного по способу-прототипу. Предлагаемый препарат вируса с одним и тем же количеством антисыворотки связывается на 30% от внесенной радиоактивности, а полученный известным способом на 50% Повышение связывания вируса, выделенного по прототипу, объясняется присутствием в его составе примесных антигенов, которые реагируют с соответствующими антителами сыворотки больных норок.

Предлагаемый способ подтверждается следующим примером конкретного выполнения.

Органы (50 г) инфицированных алеутской болезнью норок (селезенки, почки, печень) гомогенизируют в соотношении 1:10 в буферной системе, содержащей детергенты (50 мМ трис-НСl, 0,15 М NaCl, 1% тритона Х-100, 1 мМ фенилметил-сульфонилфторида, 1% дезоксихолата натрия, рН 7,2). Гомогенат обрабатывают ультразвуком трехкратно по одной минуте при частоте 22 кГц/с на аппарате УЗДН-2Т в сосуде со льдом при 4^оС. Для осаждения неразрушенных клеток гомогенат дважды центрифугируют по 30 мин при 12000 об/мин и 4^оС на центрифуге К-24. К супернатанту добавляют полиэтиленгликоль (ПЭГ-6000) и смесь выдерживают в течение 4 ч при 4^оС. Осажденный антиген уплотняют центрифугированием при 12000 об/мин 30 мин при 4^оС. Осадок растворяют в минимальном количестве ТНЭ-буфера (10 мМ трис-НСl, 0,1 М NaCl, 1 мМ натриевой соли ЭДТА, 0,05% NP-40, рН 7,4). Вирусный антиген из раствора осаждают ультрацентрифугированием при 300000 g в течение 2 ч при 4^оС, а затем осажденный антиген растворяют в 0,5 мл ТНЭ-буфера. Полученный вирусный препарат далее очищают от сопутствующих белков, в том числе и ферритина, гель-хроматографией на сефарозе 6В. Для более полной очистки вирус рехроматографируют в тех же условиях. Содержание белка в элюате контролируют проточным спектрофотометром при длине волны 280 нм.

Для определения фракций, содержащих вирусный антиген, используют конкурентный радиоиммунный анализ с меченым ¹²⁵ I-коммерческим антигеном.

Фракции, содержащие вирус, объединяют, концентрируют ультрафильтрацией до содержания белка 0,5 мг/мл и диализуют против физиологического раствора, забуференного фосфатами, рН 7,2.

Гомогенность препарата контролируют электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Чистоту полученного препарата и его соответствие антигену алеутской болезни подтверждают полосы полипептидов с М. М. 86, 76 и 28 КД и отсутствие дополнительных полос, в том числе соответствующих ферритину.

По данным электронной микроскопии полученный вирус имеет круглую форму и размеры 24-25 нм, что согласуется с данными.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ АЛЕУТСКОЙ БОЛЕЗНИ НОРОК, включающий гомогенизацию внутрених органов больных норок, обработку гомогената ультразвуком, низкоскоростное центрифугирование, ультрацентрифугирование и гель-фильтрацию препарата, отличающийся тем, что гомогенизацию осуществляют в буферной системы, содержащей детергенты с рН 7,2, после обработки ультразвуком к гомогенату добавляют полиэтиленгликоль, а ультрацентрифугирование проводят при 300000 g в течение 2 ч.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что гель-фильтрацию осуществляют на сефарозе CB.