Способ определения концентрации ионов калия в биологическом материале

 

Использование: медицина, в клинических лабораториях для определения неорганических ионов в биологических жидкостях, в частности в сыворотке или плазме крови. Сущность изобретения: у пациента берут пробу крови, затем 10 мкл плазмы или сыворотки крови помещают в инкубационную среду, содержащую 50 -10000 ед/л пируваткиназы, полученной из Bacillus stearothermophillus, 0,3 - 10 ммоль/л фосфоенолпирувата (нейтральной трис-соли), до 30 ммоль/л 4, 7, 13, 16, 21 - пентаокса-1, 10-диазабицикло-8, 8,5-трикозана, 0,10 - 0,8 ммоль/л 50 - 500 ммоль/л буфера при pH 8, 1 - 10 ммоль/л ионов марганца или магния, 2 - 100 ммоль/л хлористого лития, 0,5 - 10 ммоль/л АДФ (свободная кислота), 5000 - 100000 ед/л лактатдегидрона сыворотки, 2500 - 20000 ед/л глютаматдегидрогеназы (определено при 25 ^oС), 1 - 10 ммоль/л кетоглютарата (свободная кислота), или содержащую 50 - 1000 ед/л глицериндегидрогеназы, полученной из Enterobacter aerogenes, 0,3 - 3 ммоль/л глицерина, до 30 ммоль/л 4, 7, 13, 16, 21 - пентаокса - 1, 10 - диазабицикло - 8, 8,5 - трикозана, 0,1 - 5,0 ммоль/л NAD, 20 - 500 ммоль/л буфера pH 9, до 5 г/л альбумина сыворотки, 2500 - 20000 ед/л глютаматдегидрогеназы (определено при 25 ^oС), 1 - 10 ммоль/л кетоглютарата (свободная кислота), или содержащую 50 - 10000 ед/л ацетальдегида дегидрогеназы, полученной из дрожжей, 0,3 - 30 ммоль/л гликольальдегида, до 30 ммоль/л 4, 7, 13, 16, 21 - пентаокса - 1, 10 - диазабицикло 8, 8,5 - трикозана, 0,05 - 2,0 ммоль/л NAD , 50 - 500 ммоль/л буфера pH 7 - 8, 0,1 - 2 ммоль/л дитиотреитола, до 5 г/л сывороточного альбумина, 2500 - 20000 ед/л глютаматдегидрогеназы (определено при 25 ^oС), 1 - 10 ммоль/л кетоглютамата (свободная кислота), или содержащую 50 - 10000 ед/л ацетальдегида дегидрогеназы, 0,3 - 30 ммоль/л 4-нитрофенилацетата, до 30 ммоль/л 4, 7, 13, 16, 21 - пентаокса - 1, 10 - диазабицикло - 8, 8,5- трикозана, 0,001 - 0,1 ммоль/л NAD, 50 - 500 ммоль/л буфера рН 7 - 8, 0,1 - 2 ммоль/л дитиотреитола, до 5 г/л сывороточного альбумина, 2500 - 20000 ед/л глютаматдегидрогеназы (определено при 25 ^oС), 1 - 10 ммоль/л кетоглютамата (свободная кислота), затем инкубационную смесь инкубируют при 37 ^oС в течение 0,1 - 5 мин с последующим спектрофотометрированием при 340 нм и расчетом концентрации ионов калия с помощью калибровочной кривой. 4 з. п. ф-лы.

Изобретение относится к способам и реагентам для определения ионов калия, именуемых далее аналитами в биологических жидкостях.

Изобретение основано на способности многих аналитов стимулировать или ингибировать активность чувствительных ферментов. Аналиты могут быть катионными или анилонными, металлами или не металлами, простыми или составными. На практике часто обнаруживают, что аналиты присутствуют в образце в концентрации, которая находится вне пределов чувствительности соответствующего аналитического индикаторного фермента, или возникают сложности, связанные с наличием других ионов, к которым данный фермент также чувствителен. Изобретение касается этих проблем и разрешает их различными способами.

В практике клинической биохимии измерения электролитов в сыворотке являются наиболее обычными аналитическими тестами, которые осуществляют в больницах. Такие определения необходимы не только для рутинных исследований, но часто и в экстренных угрожающих случаях, когда важна скорость анализа.

Так как основной причиной задержек в больницах является перевозка образцов из палат в диагностические лаборатории, способ, который позволяет легко произвести определение у постели больного, представит значительную ценность в опасных ситуациях.

Обычным способом анализа калия в практике клинической биохимии является пламенная фотометрия. Этот способ основан на том, что некоторые атомы при нагревании переходят в возбужденное состояние и излучают свет характеристической длины волны при возвращении в основное состояние. Интенсивность энергии излучения на характеристической длине волны, которую излучают атомы в пламени, прямо пропорциональна количеству атомов, возбужденных в пламени, что соответственно прямо пропорционально концентрации интересующего вещества в образце. Необходимые приборы сложны, относительно дороги и требуют использования горючих газов.

В альтернативном способе, особенно для калия, используют ионоселективные электроды. В идеале каждый электрод обладает уникальным ионоселективным свойством, которое должно позволить ему реагировать только на один ион. На практике это не так, и для каждого ионоселективного электрода имеются "мешающие" ионы. Более того, ионоселективные электроды вовсе не абсолютно специфичны, хотя обычно возможны поправки. Такие электроды измеряют потенциал, создаваемый в присутствии специфического иона. Приборы относительно дорогостоящие. Ни один из способов нельзя осуществить спектрофотометрически, и поэтому клиническая потребность в определении ионов приводит к существенному усложнению коммерчески доступных клинических анализаторов, большинство из которых сконструировано главным образом для спектрометрических анализов. Оба способа требуют высокой степени профессионализма и опыта для их успешного применения.

Основным недостатком этих способов является применение растворов, содержащих высокотоксичные вещества. Некоторые способы сложны и неточны (например, титрование). Многие из реагентов нестабильны, а калибровочные кривые нелинейны (например, роданидный способ). Некоторые из этих способов нуждаются дополнительно в предварительной подготовке для исключения помех из-за содержания протеина в образце.

В аналитической биохимии W. H. Outlaw и O.H.Lowry, 92, 370-374 (1979) описан ферментативный анализ для определения ионов калия в тканях. При этом способе использована пируваткиназа из мускула кролика, которая активируется ионами кальция и ионами натрия, причем первые примерно в сорок раз более эффективны. Благодаря такой неспецифичности этот способ годится для растительных материалов, в которых ионы калия являются преобладающими, но не подходит для измерений в тканях живого организма подобных сыворотке, которые содержат тридцатикратный избыток ионов натрия. Поэтому ионы натрия вызывают неприемлемые помехи при использовании ферментативной фотометрической методики, описанной Лоури, для измерения калия в плазме или сыворотке. Другой проблемой является то, что ионы аммония аналогично активируют ионы калия. Указанный способ не предназначен для решения этих критических проблем в отношении анализа ионов калия в биологических жидкостях (таких как сыворотка), она также не предлагает никаких способов для определения ионов натрия.

Поэтому целью настоящего изобретения является создание способа и реагентов, которые позволили бы избежать вышеуказанные затруднения. В настоящем изобретении эти проблемы разрешены за счет способа определения ионов (аналитов) в биологической жидкости, в которой измеряют влияние этих ионов на активность фермента.

Ключевым признаком изобретения является использование селективно связывающих агентов для доведения свободной концентрации аналита до оптимального интервала для аналитического фермента, особенно, если разбавление жидкости невозможно. Кроме того, предлагается использовать конкурентоспособные ингибиторы соответствующего аналитического фермента для снижения его чувствительности к аналиту, что позволяет измерять последний при более высоких концентрациях. Это особенно полезно, например, если селективно связывающие агенты труднодоступны или неприемлемо дороги.

Используют селективно связывающие агенты для снижения свободных концентраций посторонних ионов до уровней, при которых их влияние более не принимается во внимание. Используют также тот факт, что конкурирующий ингибитор может взаимодействовать более эффективно с посторонними ионами, отличающимися от аналита, за счет чего возрастает чувствительность фермента к аналиту по сравнению с посторонним ионом.

Важным моментом является выбор оптимальных условий реакций, включая выбор подходящего изофермента, чтобы стимуляторные или ингибиторные воздействия аналита оказались значительно сильнее, чем для посторонних ионов. Действие аналита и посторонних ионов на активность аналитического фермента должны быть аддитивны, чтобы если известна концентрация мешающих ионов, концентрацию аналита легко можно было бы определить по разности. Если известно, что посторонний ион присутствует в относительно постоянной концентрации в анализируемой жидкости, то на него может быть сделана поправка путем включения соответствующей концентрации постороннего иона в стандартные (калибровочные растворы. Другим способом анализа таких аналитов является использование конкурентного связывающего анализа, если аналит вытесняет другой ион из связывающего агента, и определяют действие высвобожденного иона на активность соответствующего фермента.

Подходящие ферменты.

В качестве подходящих ферментов можно указать (Н.J.Eventet al. Ann.Rev. Plant. Physiol. 17, 47, 1966 следующие: трансферазу, например трансферазу, переносящую фосфорсодержащие группы. Такой трансферазой может быть пируваткиназа. Вместо пируваткиназы можно использовать и другие каналы, такие как аденилаткиназу или гексокиназу, чувствительные к иону магния или иону марганца. Другой трансферазой является ацетаткиназа (из Е.coli). Примером служит пиридоксалкиназа из мозга, которая чувствительна к ионам цинка; гидролазы, такие как гликозидаза, например α- или β -D-галактозидаза (из Е. coli), карбоксипептидаза А) из бычьей поджелудочной железы) коллагеназа (из Сlostrodium hystolicum амилаза) из слюны или поджелудочной железы) или фосфогликоллятфосотаза; пептидные гидролазы, такие как цистеин или тиолзависимые протеиназы, конкретные примеры которых Сalpain I и II, называемые также активированными кальцием нейтральными протеазами (описаны Сасаки и др. в J.Biol.Chem. 259, 12489-12494/1984). Последние феpменты можно выделить и очистить из различных тканей животных, например, из печени и почек крысы, эритроцитов человека и свиньи, мозга быка и скелетного мускула кролика по способам Китазары и др. описанным в J.Biochem. 95, 1759-1766/1984). Еще одним примером может служить дипептидиламинопептидаза (Е.С. 3.4.14.1, Cathepsin C), J.Ken. Me Donald, Bioch. Biopnys. Res Commуnication, 24(5), 66, 77f. Другим источником ферментов являются протеины, полученные с помощью генной рекомбинантной методики; оксидоредуктазы, такие как глицериндегидрогеназа (из Enterobacter aerogenes), ацетальдегидрогеназа (из дрожжей) или тиросиназа (катехолоксидаза); лиазы, такие как альдолаза (из дрожжей) или карбангидраза (из бычьих эритроцитов); различные ферменты из галофильных организмов. Другим источником ферментов являются протеины, полученные методом генной рекомбинации.

Селективные связывающие агенты.

Для связывания аналитов или посторонних ионов можно использовать широкий круг связывающих агентов. Такими связывающими или маскирующими веществами являются криптанды, коронанды, краунэфиры, поданды, сферанды, гемисферанды, каликсарены и их сочетания, природные ионофоры, например антибиотики, циклические пептиды подобные валиномицину, комплексоны и хелатирующие агенты, например иминодиуксусная кислота, ЕДТА, нитротриуксусная кислота и их производные.

Примерами хелаторов, способных связывать поливалентные ионы, в частности двухвалентные катионы, являются этиленгликоль-бис-(2-аминоэтиловый эфир)-N, N,N',N'-тетрауксусная кислота (называемая ЕGTA) и этилендинитрило (тетрауксусная кислота (ЕДТА). Хотя существует много связывающих агентов, которые могут связывать поливалентные ионы, например ЕДТА и его производные, агенты, которые способны связывать одновалентные ионы, встречаются реже. Тетрафенилбор связывает ионы калия. Однако группой соединений с более широкими возможностями являются криптаны, которые служат примерами реагентов, которые селективно связывают моновалентные катионы в водных растворах R.M.Ztaff и др. Chem. Revus, 85, 271-339). Специальными примерами криптандов являются Kryptofix® соединения фирмы Меrck-Schuchardt, например: 4,7,13,16,21-пептаокса-1,10-диазабицикло 8.8.5-трикозан, Kryptofix® 221, с. 438, каталог Меrck-Schuchardt, 1987/1988, N 810646 (К 221); 4,7,13,16,21,24-гексаокса-1,10-диазабицикло 8.8.8 гексакозан, Kryptofix® 222, с, 438, каталог Меrck-Schuchardt, 1987/1988 N 810647 (К 222).

В качестве маскирующих соединений для исключения посторонних анионов потенциально можно использовать следующие классы соединений: анионкриптанды, гетероциклофаны, катапинанды и неорганические комплексы металлов или нерастворимые соли. Конкретные примеры соединений, комплексующих анионы, описаны в литературе: например, азамоно- или азаполициклы, макроциклические четвертичные тетраэдронные соединения, макроциклические бис-металл-комплексы, макроциклы с ковалентно внедренными центрами льюисовых кислот, протонированные или алкилированные четвертичные криптанды или катапинанды (Е.Р.Schmidtchen Nachrichten Chem. Techn. lab. 36(1), 1988 S. 8f Е.Сraf. J.Amer Chem. Soc. 98(20), 1976, 6403 f; С.Н.Раги, J.Amer.Chem.Soc. 90(9), 1968, 2431), так же как, например, гексахлорный комплекс Fe(III) или нитрат серебра.

Функция связывающих агентов.

Эти связывающие агенты используют для селективного связывания мешающих ионов и для снижения концентрации аналитов до оптимально измеряемых уровней, если невозможно разбавление образца.

Одним из вариантов изобретения является способ, при котором присутствующий связывающий агент образует комплекс с "индикаторными" ионами, причем из этих комплексов индикаторные ионы стехиометрически замещаются аналитическими ионами, и определяется влияние замещенных индикаторных ионов на активность фермента, за счет чего получают косвенное определение величины концентрации аналитических ионов. Например, при таком способе ферментом служит пируваткиназа, индикаторными ионами являются ионы калия, связывающим агентом служит Kryptofix® 221, а нужно определить ион натрия; или ферментом служит киназа, индикаторным ионом является Mg⁺², связывающим агентом является хелатообразующий агент, например ЕДТА, а ионом является металл, или ферментом является пиридоксалкиназа, индикаторным ионом является Zn²⁺, связывающим агентом служит Kryptofix® 221, а ионом является тяжелый металл; или ферментом является α-амилаза, связывающим агентом является Ag или Hg, а подлежащим определению ионом является хлор; или ферментом является коллагеназа, связывающим агентом является такой хелатообразующий агент, как ЕДТА, а подлежащим определению ионом является кальций.

Жидкости для анализа.

Биологическими жидкостями, в которых проводят определение аналитов, являются кровь, сыворотка, плазма.

Применение общих принципов к определению ионов калия и натрия.

Существенным требованием для удовлетворительного способа определения ионов калия в сыворотке или плазме на основании чувствительности пируваткиназы к ионам калия является исключение помех, создаваемых ионами натря и аммония. В соответствии с общими принципами изобретения этого можно достичь одним из следующим способов: 1. Селективным связыванием ионов натрия подходящим связывающим агентом, например, Kryptofix® 221.

2. Выбором Bacillus stearothermophilus, а не мускул кроликов в качестве источника пируваткиназы, так как бактериальный фермент обладает чувствительностью к ионам калия по отношению к ионам натрия в два раза более высокой нежели фермент мускула.

3. Включением в анализ ионов, которые являются конкурирующими ингибиторами чувствительного индикаторного фермента, например использование ионов лития для конкуренции с ионами натрия и ионами калия.

4. Ферментативным делением ионов аммония.

Так как ионы лития менее эффективны в качестве конкурирующих по сравнению с ионами калия, чистый эффект состоит в повышении относительной чувствительности пируваткиназы к ионам калия еще на 50% по сравнению с ионами натрия. Более того, в присутствии ионов лития действие ионов калия и ионов натрия на активность пируваткиназы становится скорее аддитивным нежели кооперативным. Это позволяет измерять концентрацию любого из ионов калия или натрия при условии, что концентрация другого иона известна.

По способам 2 и 3 в отсутствии связывающего агента можно получить относительную чувствительность пируваткиназы для калия по сравнению с ионами натрия порядка 100:1. Это означает, что даже при чрезвычайно аномальных концентрациях ионов натрия (либо 110 либо 170 ммоль/л) ошибка в измерении концентрации ионов калия не превысит 0,3 ммоль/л относительно нормальной концентрации иона натрия в плазме 140 ммоль/л. Это не считается достаточно точным. Однако, если истинная концентрация ионов натрия в плазме известна, достижима точность измерения ионов калия вплоть до 0,05 ммоль/л. Если объединить способы 1-3 и включить связывающий агент, например, 4,7,13,16,21-пентаокса-1,10-диазабицикло-8,8,5-трикозан, относительную чувствительность пируваткиназы к ионам калия по сравнению с ионами натрия можно повысить до величины более 500:1. В этих условиях нет необходимости знать концентрацию ионов натрия для определения концентраций ионов калия в плазме вплоть до 0,05 ммоль/л.

Эти способы определения иона калия демонстрируют применимость общих принципов, разработанных в изобретении в плане снижения посторонних влияний.

Аналитические способы для ионов калия. Для определения ионов калия жидкость, например плазму крови, инкубируют с буферированной смесью, содержащей аденозиндифосфат (АДР), фосфоенолпируват (РЕР), восстановленный никотинамидадениндинуклеотид (NАДН), пируваткиназу (РК) и лактатдегидрогеназу (LДH). Образование пирувата и затем лактата в этой смеси, в реакциях катализируемых РК и затем лактата в этой смеси, в реакциях катализируемых РК и LDH, полностью зависит от присутствия соответствующих катионов, при отсутствии которых РК полностью неактивен. NАДН сильно поглощает на 340 нм, тогда как NAД не поглощает.

В условиях, выбранных для анализа, которые включают наличие ионов марганца, которые необходимы бактериальной РК, скорость окисления АДН пропорциональна концентрации ионов калия.

В этих условиях происходят следующие реакции:
PEP + AДP + H⁺ Пируват + ATP (1)
Пируват + NAДH + H⁺ Лактат + NAД⁺ (2)
Скорость реакции (1) определяется концентрацией присутствующих ионов калия в системе, а это ограничивает скорость реакции (2). Существует несколько способов, которыми можно измерять скорость этих реакций. Стандартным способом является спектрофотометрическое определение скорости исчезновения NАДН в реакции (2). NАДН сильно поглощает на 340 нм, тогда как NАД не поглощает вовсе. Соответственно падение поглощения реакционной смеси при 340 нм (или альтернативной длине волны) обеспечивает прямое измерение скорости реакции, и отсюда можно получить концентрацию ионов калия, имеющихся в смеси. В другом варианте выгодно использовать тот факт, что обе реакции (1) и (2) потребляют Н⁺, понижая тем самым концентрацию протонов в реакционной смеси. Скорость уменьшения концентрации протонов можно измерить рН-метром или титрованием. В последнем случае концентрация используемого буфера должна быть гораздо меньше, чем при спектрофотометрическом способе. Для записи активности пируваткиназы можно использовать флюориметры или люминометры, или другое оборудование.

Существует целый ряд других способов определения накопления пирувата, ассоциированного с РК активностью. Они включают способ измерения неорганических фосфатов или поглощенного кислорода, или перекиси водорода; ацетилфосфат или двуокись углерода, вырабатываемые под действием фермента пируватоксидазы; образование гидразона с 2,4-динитрофенилгидразином, измерение реагентов или продуктов ферментативного действия пируваткарбоксилазы; пируватдекарбоксилаза или пируватдегидрогеназа; применение системы соединенных с флавинами; изотопные способы измерения малых концентраций субстратов (Analytical Biochem. 118, 344-352 (1981).

При изучении 200 образцов сыворотки было достигнуто хорошее согласование с другими способами, например, пламенной фотометрией и измерениями ионоселективными электродами. При этом способе значительные помехи вызывают ионы аммония, которые обычно присутствуют в сыворотке или вырабатываются при стоянии. Возможности помех за счет ионов аммония можно полностью избежать, включив в реакционную смесь α-кетоглютарат (КG) и глутаматдегилрогеназу (GДН). Ионы аммония удаляются при предварительном инкбировании в соответствии с реакцией:
NH₄+KG+NAДH ___→ глутамат + NAД⁺
В таких растворах как моча, в которых содержание ионов аммония может быть высоко, используют парную реакцию:
NH₄+KG++NAДPH __→ глутамат + NAДPH
глюкоза-P-З+NAДP ___→ 6-фосфоглюконат + NAДPH
Объединенный способ используют глюкозу-6-фосфатдегидрогеназу. При условии, что добавляемые глюкоза-6-Р и -КG-находятся в избытке ко всем присутствующим ионам аммония, все ионы аммония будут удалены, а NАДН сохранится в реагенте.

Типичные интервалы концентраций основных реагентов для ферментативного определения при 37^оС ионов калия с использованием 10 мкл образца плазмы или сыворотки следующие: РК (В. Stearothermophilus 50 ед/л до 10000 ед/л PEP (нейтрали- зованная Трис соль) 0,3 30 ммоль/л 4,7,13,16,21- пентаокса- 1,10-диазабицикло- 8,8,5-трикозан До 30 ммоль/л АДН 0,01 0,8 ммоль/л Буфер, рН 7-8 50-500 ммоль/л Mn²⁺ или Mg²⁺ 1-10 ммоль/л LiCl 2-100 ммоль/л АДР (свободная кислота) 0,5-10 ммоль/л LДН (определено при 25^оС) 5000-100000 ед/л Сыворотка альбумина До 5 г/л GДН (определено при 25^оС) 2500-20000 ед/л KG (свободная кислота) 1-10 ммоль/л
Другим примером чувствительным к ионам калия является глицериндегидрогеназа (Е.С.С. Linet al B, 235, 1820, 1960).

Интервал типичных концентраций основных реагентов для ферментативного определения при 37^оС ионов калия с использованием глицериндегидрогеназы является следующим; Глицеринде- гидрогеназа 50-1000 ед/л Глицерин 0,3-3 моль/л 4,7,13,6,21- пентаокса-1,10- диазабицикло-8,8,5- трикозан До 30 ммоль/л NАД 0,1-5,0 ммоль/л Буфер, рН 9 20-500 ммоль/л Сыворотка альбумина До 5 г/л GДН (определено при 25^оС) 2500-20000 ед/л КG (свободная кислота) 1-10 ммоль/л
Другим ферментом, чувствительным к ионам калия, является ацетальдегиддегидрогеназа (Arch.Biochem.Biophys. 34, 86, 1951).

Типичный интервал концентраций основных реагентов для ферментативного определения ионов калия при 37^оС составляет: Ацетальдегид- дегидрогеназа 50-10000 ед/л Гликольальдегид 0,3-30 ммоль/л 4,7,13,16,21- пентаокса-1,10- диазабицикло-8,8,5- трикозан До 30 ммоль/л NАД 0,05-2,0 ммоль/л Буфер, рН 7-8 50-500 ммоль/л Дитиотреитол 0,1-2 ммоль/л Сыворотка альбумина До 5 г/л GДН (определено при 25^оС) 25000-20000 ед/л КG (свободная кислота) 1-10 ммоль/л. Гликольальдегид можно заменить на ацетальдегид (0,02-1 ммоль/л).

Ацетальдегиддегидрогеназа также демонстрирует эстеразную активность, так что концентрацию ионов калия можно определять, регистрируя высвобождение 4-нитрофенола из 4-нитрофенил-ацетата. Типичные интервалы концентраций основных реагентов для ферментативного определения ионов калия при 37^оС на основании эстеразной активности ацетальдегиддегидрогеназы: Ацетальдегид дегидрогеназа 50-10000 ед/л 4-Нитрофени- лацетат 0,1-2 ммоль/л 4,7,13,16,21- пентаокса-1,10- диазабицикло-8,8,5- трикозан До 30 ммоль/л NАДН 0,001-0,1 ммоль/л Буфер, рН 7-8 50-500 ммоль/л Дитиотреитол 0,1-2,0 ммоль/л Сыворотка альбумина До 5 г/л GДН (определено при 25^оС) 2500-20000 ед/л
КG (свободная кислота) 1-10 ммоль/л.

В нижеприведенных примерах образцы небольшого объема (10 мкл), если нет других указаний в случае сыворотки или плазмы), смешивают с реагентом 1, содержащим буферированный субстрат и некоторые факторы, и инкубируют в течение некоторого времени, обычно 0,1-5 мин. Значения поглощения обычно считывают с определенными интервалами во время этого инкубационного периода. Затем добавляют реагент 2, содержащий фермент, и записывают скорость реакции. В некоторых примерах реагент 1 содержит индикаторный фермент, а реагент 2 соответствующий субстрат. В примерах указана окончательная реакционная смесь после того, как смешивают образец, реагент 1 и реагент 2.

П р и м е р А. Измерение концентрации ионов калия с помощью пируваткиназы без агента, связывающего ионы натрия, причем концентрация ионов натрия неизвестна.

Окончательная инкубируемая смесь содержит: 175 ммоль/л Трис-НСl буфер, рН 7,4, 20 ммоль/л Li/17 ммоль/л ОН, 3 ммоль/л Сl), 3,0 ммоль/л MnCl₂, 2,6 ммоль/л АДР (свободная кислота), 2,9 ммоль/л РЕР (нейтрализованная Трис соль), 0,4 ммоль/л NАДН, 17000 ед/л LДН (определено при 25^оС), 890 ед/л РК из Bacillus stearothermophilus, 4,0 ммоль/л КG 8600 ед/л GДН (в глицерине, определено при 25^оС), 140 мг/л альбумина сыворотки человека.

Стандарты для ионов калия (калибровочные растворы) содержат 140 ммоль/л ионов натрия для компенсации стимуляторного действия ионов натрия, присутствующих в плазме на пируваткиназу.

П р и м е р В. Определение концентрации ионов калия с использованием пируваткиназы без агента, связывающего ионы натрия; концентрация ионов натрия известна.

Инкубируемая смесь и калибровочные растворы тe же, что и в примере А.

На концентрацию ионов натрия в смеси можно внести поправку, добавляя (или вычитая) 0,1 ммоль/л калия на каждые 10 ммоль/л концентрации ионов натрия, которая ниже (или выше) 140 ммоль/л ионов натрия. Однако такую поправку следует проверить, исследуя водные растворы, содержащие известные концентрации ионов натрия и калия.

П р и м е р С. Определение концентрации ионов калия с использованием пируваткиназы в присутствии агента, связывающего ионы натрия. Методика по примеру С, но без альбумина сыворотки человека, и среда содержит, кроме того, 6 мкмоль 4,7,13,16,21-пентаокса-1,10-диазабицикло-8,8,5-трикозана на анализ. рН выбирают 7, 8 для того, чтобы минимизировать отклонения в вытеснении ионов натрия из 4,7,13,16,21-пентаокса-1,10-диазабицикло-8,8,5-трикозана за счет различного содержания ионов калия в отдельных образцах.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ИОНОВ КАЛИЯ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ, отличающийся тем, что плазму или сыворотку крови в объеме 10 мкл помещают в инкубационную среду, содержащую фермент, связующий агент, который связывает мешающие ионы, и/или снижает концентрацию ионов калия до оптимального уровня для измерения, и/или снижает сродство фермента к ионам калия, индикатор, конкурирующий ингибитор фермента, буфер, затем инкубационную смесь инкубируют при 37^oС в течение 0,1 - 5 мин с последующим спектрофотометрированием при 340 нм и расчетом концентрации ионов калия с помощью калибровочной кривой.

2. Способ по п.1 отличающийся тем, что ферментом является пируваткиназа, полученная из Basillus stearothermophillus, а инкубационная смесь состоит из 50 - 10000 ед/л указанного фермента, 0,3 - 30 ммоль/л фосфоенолпирувата (нейтральное триссоли), до 30 ммоль/л 4, 7, 13, 16, 21-пентаокса-1,10-диазабицикло-8,8,5-трикозана, 0,01 - 0,8 ммоль/л N АДН, 50 - 500 ммоль/л буфера с pH 8, 1 - 10 ммоль/л ионов марганца или магния, 2 - 100 ммоль/л хлористого лития, 0,05 - 10 ммоль/л АДФ (свободной кислоты), 5000 - 100000 ед/л лактатдегидрогеназы (определено при 25^oС), до 5 г/л альбумина сыворотки, 2500 - 20000 ед/л глютаматдегидрогеназы (определено при 25^oС), 1 - 10 ммоль/л кетоглютарата (свободная кислота).

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что ферментом является глицериндегидрогеназа, полученная из Enterbacter aerogenes, а инкубационная смесь состоит 50 - 1000 ед/л указанного фермента, 0,3 - 3 ммоль/л глицерина, до 3 ммоль/л 4, 7, 13, 16, 21-пентаокса-1,10-диазабицикло-8,8,5-трикозана, 0,1 - 5,0 ммоль/л N АД, 20 - 500 ммоль/л буфера с pH 9, до 5 г/л альбумина сыворотки, 2500 - 20000 ед/л глютаматдегидрогеназы (определено при 25^oС), 1 - 10 ммоль/л кетоглютарата (свободная кислота).

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что ферментом является ацетальдегид дегидрирогеназы, полученной из дрожжей, а инкубационная смесь состоит из 50 - 10000 ед/л указанного фермента, 0,3 - 30 ммоль/л гликольальдегида, до 30 ммоль/л 4, 7, 13, 16, 21-пентаокса-1,10-диазабицикло-8,8,5-трикозана, 0,05 - 2,0 ммоль/л N АД, 50 - 500 ммоль/л буфера с pH 7 - 8, 0,1 - 2 ммоль/л дитиотреитола, до 5 г/л сывороточного альбумина, 2500 - 20000 ед/л глютаматдегидрогеназы (определено при 25^oС), 1 - 10 ммоль/л кетоглютамата (свободная кислота).

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что ферментом является ацетальдегид дегидрогеназы, а инкубационная среда состоит из 50 - 10000 ед/л указанного фермента, 0,3 - 30 ммоль/л 4-нитрофенилацетата, до 30 ммоль/л 4, 7, 13, 16, 21-пентаокса-1,10-диазабицикло-8,8,5-трикозана, 0,0001 - 0,1 ммоль/л N АД, 50 - 500 ммоль/л буфера с pH 7 - 8, 0,1 - 2 ммоль/л дитиотреитола, до 5 г/л сывороточного альбумина, 2500 - 20000 ед/л глютаматдегидрогеназы (определено при 25^oС), 1 - 10 ммоль/л кетаглютамата (свободная кислота).