Способ получения этанольного продукта

 

Использование: в спиртовой и винодельческой промышленности. Сущность изобретения: водный сахарсодержащий субстрат пропускают через один или множество реакторов, содержащих иммобилизованные на носителе дрожжевые клетки, и ферментируют его с получением этанольного продукта. Множество реакторов соединены последовательно и снабжены средствами для удаления газа из ферментируемого субстрата. Субстрат пропускают через реактор под давлением, обеспечивающим поддержание значительной части образовавшегося при ферментации диоксида углерода в растворенном состоянии для получения газированного этанольного продукта. Можно пропускать его в направлении, противоположном действию силы тяжести, или изменять направление движения его на обратное. В качестве носителя используют носитель, обладающий анионообменными свойствами и представляющий собой сплошную пористую матрицу или шероховатые, либо сетчатые пористые частицы, причем матрица или частицы имеют структуру, образованную из свободно связанного множества микрочастиц или микроволокон, которые химически, адгезионно или механически связаны друг с другом по крайней мере в некоторых контактных точках между индивидуальными микрочастицами или микроволокнами. Микроволокна, образующие частицы, или микрочастицы состоят из анионообменной смолы, которую выбирают из группы, состоящей из природной или регенерированной целлюлозы, дериватизированной для обеспечения анионообменных свойств. Носитель представляет собой микроволокна, агломерированные с полистиролом. Анионообменная смола представляет собой диэтиламиноэтилензамещенную целлюлозу. 8 з. п. ф-лы, 1 ил., 2 табл.

Изобретение относится к производству алкогольсодержащих напитков с использованием иммобилизованных дрожжей, а точнее к способу получения этанольного продукта, предусматривающему пропускание водного сахаросодержащего субстрата через по меньшей мере один реактор, содержащий иммобилизованные на носителе дрожжевые клетки, и ферментацию указанного субстрата с получением этанольного продукта.

Хорошо известные недостатки традиционных периодических технологий спиртового брожения сравнительно недавно привели к созданию технологии, использующей дрожжи, иммобилизованные на подходящем носителе, загруженном в колонну реактора. Высокая концентрация дрожжевых клеток, получаемая при этой технологии, а также значительное увеличение площади контакта сусла с дрожжевыми клетками привело к существенному ускорению процесса ферментации. В реакторе колонного типа уменьшена также степень ингибирования этанолом, поскольку этанолсодержащий продукт непрерывно отводится из слоя дрожжей. Степень такого уменьшения достигает максимального значения при реализации идеальной ситуации закупоренного потока.

Известно, что альгинат кальция способен захватывать дрожжевые клетки, и полученные в результате этого иммобилизованные дрожжи могут использоваться для быстрой ферментации. В многочисленных литературных ссылках такая методика описана применительно к лабораторным условиям. Однако предпринимались также некоторые попытки для коммерческого использования такого метода. Одна из лучших таких попыток, по-видимому была предпринята Киова Хакко в Японии по получению пищевого этанола с использованием альгинат-иммобилизованных дрожжей.

Для операции промышленного масштаба основной трудностью альгинатной иммобилизации является способ образования частиц. Этот процесс должен протекать на производительном участке, где имеет место перемешивание дрожжевой суспензии и раствора альгината натрия. Когда такую смесь подают в раствор соли кальция, альгинат осаждается и в то же время оклюдирует дрожжевые клетки внутри осажденных частиц. Такие частицы обычно имеют форму капель или шариков.

Промышленная установка, в которой используются захваченные альгинатом дрожжи, должна иметь специальное сконструированное оборудование, предназначенное для получения таких шариков. Кроме этого, имеется потенциальная опасность загрязнения дрожжей дикими микроорганизмами. Это особенно важно для производства напитков со спиртовым запахом (например, пива, вина, сидра и других продуктов такого типа). В случае производства технического или топливного этанола критерий загрязнения не играет такой важной роли, как в случае получения потребительского этанола, однако он может оказывать влияние на производительность.

Второй основной трудностью, касающейся применения альгинатных шариков в промышленном масштабе, является физическая прочность таких шариков. Такие шарики являются мягкими и могут легко сжиматься. Эксплуатация крупных ферментационных колонн может стать проблемой, и быстрыми обратными процессионными потоками трудно управлять. С другой стороны, если ферментацию осуществляют обычным способом с движением потока вверх, то шарики сильно изнашиваются. Аналогичным образом работа реактора с потоком, стекающим вниз под давлением, невозможна в случае используемого сжимаемого материала.

Третья трудность, связанная с захватыванием, состоит в диффузионных ограничениях, которые снижают доступность субстрата к контактированию с дрожжами внутри шарика.

Наконец, если система загрязняется или нарушается как-либо иначе, непрерывный процесс следует остановить и целую партию материала с колонны (альгинат совместно с дрожжами) приходится выбрасывать. Повторное использование в этом случае невозможно.

В связи с этим цель предлагаемого изобретения заключается в разработке способа непрерывной ферментации в колонне, который не требовал бы формирования колонного материала на месте. Другой целью является разработка способа устранения источников загрязнения. Еще одна цель состоит в создании способа, способного выдерживать давление. Другая цель изобретения создание способа, в котором материал-носитель можно регенерировать и использовать повторно. Другие цели изобретения включают создание процессов получения спирта с достаточно высокими скоростями, по крайней мере минимально около одного объема слоя 5%-ного спирта в день.

Вышеуказанные и другие цели достигаются предлагаемым изобретением, согласно которому в способе получения этанольного продукта, предусматривающем пропускание водного сахаросодержащего субстрата через по меньшей мере один реактор, содержащий иммобилизованные на носителе дрожжевые клетки, и его ферментацию с получением этанольного продукта, в качестве носителя используют носитель, обладающий амионно-обменными свойствами и представляющий собой сплошную пористую матрицу или шероховатые, либо сетчатые пористые частицы, причем указанные матрица или частицы имеют структуру, образованному из свободно связанного множества микрочастиц или микроволокон, которые химически, адгезионно или механически связаны друг с другом по меньшей мере в некоторых контактных точках между отдельными микрочастицами или микроволокнами.

Такая структура носителя обеспечивает максимальную площадь поверхности для находящихся на нем дрожжевых клеток. Полученное в итоге высокое количество дрожжевых клеток на единицу объема позволяет значительно ускорить ферментацию.

Носитель, состоящий из частиц или выполненный в виде матрицы, получают простым объединением, войлокованием, сплетением, смешиванием или агломерированием микрочастиц или микроволокон. Связывание осуществляется путем создания химических, клеевых (адгезионных) или механических связей в некоторых точках контакта между индивидуальными микрочастицами или микроволокнами. Клеевое соединение осуществляется путем агломерирования или склеивания микроволокон или микрочастиц в результате использования такого дополнительного ингредиента, как термопластичная смола. Механическое связывание осуществляют путем спутывания или связывания волокон в точках контакта или соединения частиц путем сцепливания их поверхностей. В последнем случае матрица будет представлять собой сплошную структуру в реакторе, больше похожую на хлопковый пух или фильтровальную бумагу, загруженную в трубу. После этого частицы в их окончательной форме будут дискретными и индивидуальными.

Микроволокна или микрочастицы состоят из любого анионообменного вещества, которое может формироваться в желаемые микроволокна или микрочастицы с неровной поверхностью. Такие вещества включают природную или регенерированную целлюлозу или синтетический шелк, которые подвергают дериватизации с целью придания анионообменного характера; такие синтетические анионообменные смолы, как фенольформальдегидные смолы, а также анионообменные смолы на основе агарозы или декстрина. Предпочтительный носитель представляет собой пористую анионообменную смолу на основе целлюлозы или искусственного шелка, которые подвергают химической модификации с целью придания им анионообменного характера. Особенно предпочтительные воплощения включают микроволокна или микрочастицы диэтиламиноэтилензамещенной целлюлозы, крепко связанные путем агломерации с полистиролом.

Предполагается, что электрические силы, возникающие между положительно заряженной смолой и отрицательно заряженными дрожжевыми клетками, главным образом ответственны за связывание дрожжевых клеток с поверхностью смолы. Такое связывание минимизирует степень выщелачивания дрожжей и обеспечивает тесный контакт между дрожжами и водной средой.

Водный субстрат, используемый в качестве исходного материала, состоит по крайней мере из воды такого способного к ферментации карбогидрата, как гидролизованный крахмал, сахароза, глюкоза, фруктоза, мальтоза или мальтотриоза (лактоза и ксилоза). Концентрация сахара должна быть достаточной для осуществления непрерывного получения спирта, но не должна быть слишком высокой, поскольку в этом случае ферментная активность дрожжей будет полностью ингибироваться.

В соответствии со способом предлагаемого изобретения важно контролировать такой параметр процесса, как количество диоксида углерода, выделяющегося в ходе ферментации. Диоксид углерода может сохраняться в потоке жидкого продукта или удаляться. Согласно предпочтительному способу используются серии колонн, взаимные соединения которых сконструированы таким образом, чтобы обеспечить удаление газа из потока, выходящего сверху колонны. Если на всех колоннах используют соединительные отводы, то получают продукт без образования карбонатов. Используя колонны под давлением, можно получить карбонизированный продукт. Однако давление в колоннах не должно быть таким высоким, чтобы уменьшалась степень ферментации под действием дрожжей. Этот предел легко установить традиционными методами и обычно он составляет по крайней мере 14 бар.

Помимо давления можно менять другие параметры процесса с целью осуществления выпуска этанола и обеспечения вкусовых качеств продукта. Такие параметры включают температуру колонны, скорость подачи водного субстрата, время пребывания в колонне, направление потока субстрата в колонне (вдоль или против действия силы тяжести периодическое изменение направления потока), штамм дрожжей, концентрацию дрожжей и питательные вещества для дрожжей, содержащиеся в водном субстрате. Подходящие интервалы изменения таких параметров включают температуру (-2)-(+40)^оС, скорость подачи 0,01-10объемов реакционного слоя (BУ) в 1 ч, время пребывания в колонне 0,1-100 ч и концентрацию дрожжей 10⁹-10¹² дрожжевых клеток на 1 л носителя. Можно использовать такие дрожжи, как Soccharomyces или Candida. Обычно указанные параметры регулируют таким образом, чтобы получить этанол с концентрацией 0,05-15% В соответствии с предпочтительным способом изобретения, вначале в колонну загружают конкретный носитель и носителю дают оседать в колонне с насадкой. Носитель стерилизуют методами, известными per se, например путем промывки горячей щелочью. После нейтрализации стерильным разбавленным раствором кислоты и ополаскивания стерильной водой колонну далее омывают дрожжевым бульоном, в результате чего дрожжи присоединяются и иммобилизуются на частицах носителя. После такой предварительной обработки колонну с дрожжами используют, как описано ниже.

Согласно еще одному предпочтительному способу предлагаемого изобретения получают этанольный продукт, обладающий потребительскими свойствами. Такой продукт может представлять собой вино, саке, алкогольный фруктовый, ягодный или овощной напиток, их газированные варианты, пиво или варианты перечисленных продуктов с низким содержанием алкоголя.

Водный субстрат, используемый для получения потребительского продукта, получают из таких источников, как фрукты, ягоды или овощные соки, или экстракты, сусло, гидролизованный растительный материал или водный сироп, содержащий способный к ферментации сахар природного или синтетического происхождения. В качестве сока может использоваться жидкость, выжатая из фруктов, ягод или овощей. Экстракт может представлять собой жидкость, полученную путем объединения фруктов, ягод или овощей с водой и обработки полученной системы машинным методом, варкой, отжиманием, смешиванием и т.п. В качестве гидролизованного растительного материала может использоваться материал на основе целлюлозы, полуцеллюлозы и/или крахмала после обработки его методами кислотного, энзимного или авто-гидролиза.

Другой способ предлагаемого изобретения относится к производству напитков с низким содержанием алкоголя, например таких, которые содержат менее 0,2 об. спирта. В соответствии с таким способом используют те же процессионные стадии и тот же материал дрожжи-носитель, что и в основном способе производства. Однако содержание сахара и скорость подачи водного субстрата изменяют таким образом, чтобы обеспечить производство продукта с низким содержанием спирта. Скорость подачи повышают до такой степени, чтобы понизить концентрацию спирта до желаемой величины. Кроме того, путем понижения температуры можно уменьшить скорость ферментации. Концентрация сахара также регулируется соответствующим образом так, что напиток не будет чрезмерно сладким даже в том случае, когда присутствует достаточное количество сахара для ферментации в спирт. В результате непрерывного регулирования параметров процесса можно выбрать желаемый уровень содержания спирта.

Предлагаемое изобретение относится также к комбинации носителя и дрожжей в любой форме. Предпочтительные формы включают те, что получают in situ в соответствии с описанным выше, а также высушенную комбинацию. Высушенная комбинация в асептическом состоянии может упаковываться, транспортироваться на ферментационную установку и переформировываться для использования путем нагружения в водное питательное вещество. С другой стороны, высушенная форма может упаковываться для домашнего применения.

На чертеже показана схема подготовки колонн с иммобилизованными дрожжами.

На чертеже показан сосуд 1 гидратации, реактор 2 с иммобилизованными дрожжами, сосуд 3, стерилизации жидкости, сосуд 4 кислотной нейтрализации, сосуд 5 для дрожжевой суспензии, сосуд 6 для субстрата, канал 7 для отделения диоксида углерода, сосуд-приемник 8 и клапан 9 для сброса давления.

Предлагаемое изобретение базируется на системе дрожжи-носитель, описанной выше, которая является несжимаемой и способной к стерилизации. Особенно предпочтительным примером носителя, используемого для получения системы дрожжи-носитель, является ДЕАЕ-целлюлоза (слабый анионообменник), агломерированная с полистиролом. Такой носитель выпускается промышленностью и хорошо известен для иммобилизации энзимов, особенно изомеразы (патент США N 4 355 117, в котором приводятся подробности, касающиеся такого носителя).

Согласно предпочтительному способу получения системы дрожжи-носитель (чертеж) сухой носитель подвергают гидратации в гидратационном сосуде 1 и перекачивают в колонный реактор 2. Предпочтительный носитель на основе ДЕАЕ-целлюлозы устойчив в кислотной и щелочной среде и может выдерживать температуры до 100^оС. Таким образом, он может легко стерилизоваться в колонне, например, с помощью горячей щелочи. Другие смолы могут стерилизоваться аналогичным образом.

Иммобилизация дрожжей на носителе проводится после стерилизации носителя горячей разбавленной каустической содой. Затем слой носителя прополаскивают водой и нейтрализуют путем прокачивания подходящей разбавленной кислоты через слой носителя; наконец слой носителя прополаскивают стерильной водой. Иммобилизацию осуществляют путем перекачивания суспензии культивированных, активных дрожжей в реактор 2. Затем носитель адсорбирует дрожжи. Дрожжевые клетки присоединяются к поверхностям носителя в результате оптимальной формы поверхности носителя.

Предпочтительно, когда дрожжевые клетки растут на носителе с обеспечением плотности 10⁹-10¹² клеток на 1 л носителя, причем плотность порядка 10⁹ клеток особенно предпочтительна. Такая плотность должна быть достаточной для того, чтобы обеспечить достаточную энзимную активность с тем, чтобы в значительной мере превратить сахара в водном субстрате в этанол.

Субстрат из сосуда 6 перекачивают через реактор через донный или верхний входы. Путем регулирования объемной скорости можно контролировать степень ферментации. Низкая объемная скорость (около 1 ВУ/день) обозначает длительное время контакта между носителем и субстратом и, таким образом, высокие уровни спирта. Увеличение скорости потока уменьшает уровень содержания спирта. Реактор может работать при атмосферном давлении, причем подача сырья производится через донный вход, а диоксид углерода свободно выделяется из системы через сепарационный отвод (канал) 7. Продукт собирают в сосуде-приемнике 8, из которого его далее направляют на фильтрацию и т.д. перед окончательным укупориванием в бутылки.

В том случае, когда система работает под давлением, субстрат из сосуда 6 подают через верхний вход с тем, чтобы удерживать слой носителя в компактной форме и таким образом достичь состояния закупоривания потока. Скорость ферментации регулируется таким образом (с помощью объемной скорости), что приложенное давление достаточно для того, чтобы образовавшийся диоксид углерода растворялся в системе. Давление сбрасывают через клапан 9 на сосуде-приемнике, если желательно, чтобы конечный продукт содержал диоксид углерода. Для того, чтобы поддерживать давление и количество растворенного диоксида углерода в разумных границах, рекомендуется использовать два или более аналогичных реакторов 2, соединенных последовательно, и сбрасывать избыток диоксида углерода между каждым реактором.

Носитель может регенерироваться путем подачи горячей едкой щелочи через слой носителя до достижения материалом однородного светлого цвета. После этого носитель прополаскивают водой до значения рН 10 и нейтрализуют путем прокачивания подходящей разбавленной кислоты через слой носителя. Наконец носитель прополаскивают стерильной водой.

Важность носителя состоит в том, что он обеспечивает адекватные окружающие условия для роста дрожжей и контактирование с водным субстратом. Несжимаемый анионообменный носитель, такой как агломерированная ДЕАЕ-целлюлоза, обладает некоторыми преимуществами по сравнению с такими мягкими, гель-подобными носителями, как альгинатные шарики. К таким преимуществам относятся меньшее число проблем, связанных с массопередачей, облегчение иммобилизации, более быстрый запуск установки, облегчение масштабирования, значительно улучшенная способность к регенерации и длительный срок службы носителя.

В лабораторном масштабе было проведено сравнение гельподобного носителя, т. е. альгинатных шариков и предпочтительного носителя изобретения, т.е. ДЕАЕ-целлюлозных гранул. Носитель, выполненный из ДЕАЕ-целлюлозы, было легче использовать для производства этанола и при использовании большого числа субстратов такой носитель обеспечивал наиболее желательную производительность. Эти факторы предполагают лучший контакт между дрожжами и водным субстратом в ходе обработки. Не ограничивая предлагаемое изобретение, предполагается, что тип взаимодействия иммобилизованных дрожжей и носителя согласно предлагаемому изобретению может служить объяснением получению повышенного выхода. Электронные микрофотографии показывают, что в альгинатных шариках дрожжи растут колониями, причем некоторые из таких колоний прорастают через альгинатный слой и поверхности шарика. Предполагается, что дрожжевые колонии действуют, как "активные участки" альгинатных шариков. Микрофотографии показывают, что гранулы ДЕАЕ-целлюлозы представляют собой пористые, сетчатые матрицы микроволокон. Такая структура позволяет водному субстрату достигать дрожжевых клеток, растущих внутри гранул. Таким образом, дрожжи растут достаточно свободно и раздельно во внешних и внутренних карманах микроволокон, и такие индивидуальные клетки действуют в колонне как "активные ферментационные участки". В соответствии с этим в этом случае, когда используется носитель предлагаемого изобретения, в ферментации принимает участие большее количество дрожжевых клеток в расчете на единицу площади поверхности такого носителя.

Механизм иммобилизации дрожжевой клетки на поверхности носителя, например гранулярной ДЕАЕ-целлюлозы, предлагает большое число преимуществ. Во-первых, практически все дрожжевые клетки находятся на поверхности носителя. В результате этого клетки действуют так, как если бы они были свободно суспендированы в растворе.

Во-вторых, не имеется существенных диффузионных ограничений, и ферментируемый жидкий субстрат может свободно контактировать с дрожжами. Кроме того, необходимые для жизни клеток питательные вещества имеются в распоряжении, и отсутствуют затруднения в их проникновении во внутрь частиц носителя.

В-третьих, свойства носителя согласно изобретению позволяют легко запускать установку и осуществлять регенерацию, поскольку иммобилизация дрожжевых клеток внутри колонны может происходить in situ. Такой метод понижает опасность загрязнения и улучшает условия существования системы в целом. Кроме этого, колонну можно легко подвергать регенерации, что представляет собой важное экономическое преимущество. Регенерация иногда является целесообразной из-за наличия химических примесей, или загрязнений водной среды, микробиальных загрязнений или из-за мутаций самих иммобилизованных дрожжей. Для регенерации колонного реактора, в котором используется такой носитель, как ДЕАЕ-целлюлоза, отработанную колонну можно промывать и стерилизовать горячим щелочным раствором или другой стерилизующей жидкостью, такой как органический агент в воде и т.п. После промывки и нейтрализации носитель легко запускать в работу и повторно подвергать иммобилизации. При работе в пилотном масштабе такая колонна эксплуатировалась в течение по крайней мере 13 недель без потребности в регенерации. При работе в лабораторном масштабе аналогичная колонна использовалась в течение 30 недель.

Как правило, вся реакторная система, включая реактор, может быть стерилизована путем описанной выше обработки. При последующем прокачивании асептически культурированных дрожжей или их элюировании через слой носителя опасность загрязнения системы дрожжи-носитель дикими штаммами или бактериями минимизируется. При соединении дрожжей с материалом колонки (подходящая загрузка составляет 10⁹-10¹² дрожжевых клеток на 1 л носителя) колонку можно дополнительно кондиционировать медленным прокачиванием такого питательного раствора, как водный раствор фосфата аммония и сахара, через реактор в течение примерно одного дня. Такой способ вызывает разрастание дрожжей до максимальной плотности.

Обычно для всех систем дрожжи-носитель, используемых согласно изобретению, одно из предпочтительных воплощений носителя гранулированная ДЕАЕ-целлюлоза является несжимаемой (ненабухающей). Такое свойство предполагает большое число вариантов осуществления ферментации.

При нормальном атмосферном давлении система реактор-ферментер непрерывного действия может действовать следующим образом. Субстрат подается со дна реактора, а СО₂, образующаяся в ходе ферментации, свободно выделяется из слоя носителя. Однако согласно такому методу идеальная ситуация замкнутого потока не достигается (пузырьки СО₂ всегда нарушают слой), и обратное перемешивание вызывает этанольное ингибирование и таким образом понижает производительность.

Система с несжимаемым носителем согласно предлагаемому изобретению может работать также и при повышенном давлении с тем, чтобы удерживать диоксид углерода в растворенном состоянии. Кроме этого, колонна может работать в условиях течения потока вниз, и в такой системе со слоем насадки достигается ситуация идеального закупоренного потока.

Несколько колонн под давлением могут также соединяться последовательно с тем, чтобы избежать использования высокого давления. Такое последовательное соединение особенно полезно, если в конечном продукте желательно иметь высокую концентрацию спирта. Такой способ позволяет проводить эксплуатацию с течением потока вниз без вредного выделения диоксида углерода, которое может нарушать насадочный характер колонны, т.е. вызывать каналовый эффект. Между колонками диоксид углерода выделяют из потока. Может также использоваться реактор меньшего размера, поскольку не требуется избыточного ожижения и пространства для отделения диоксида углерода.

Как правило, любой ферментируемый жидкий субстрат может использоваться в качестве сырья для производства этанольного продукта при условии, что любые конкретные примеси отфильтровываются перед подачей в колонну с иммобилизованными дрожжами. Примерами типичных субстратов могут служить (I) сусло, (II) фруктовый сок, (III) ягодный сок, (IV) сахарный сироп, (V) крахмальный сироп, (VI) любой гидролизат растительного материала, (VII) сахарный сироп, отдушенный любым фруктовым, ягодным солодовым или аналогичными сиропами, (VIII) любой водный сироп, используемый для производства пива, вина или ликера.

Типичная общая концентрация сахара будет составлять 100-250 г/л, включая как исходные, так и добавленные сахара в зависимости от природы сырья. Питательные вещества для дрожжей (включая источники фосфора, азота и т.п.) должны быть сбалансированы, если их не хватает в исходном сырье. Разумеется, концентрация сахара может изменяться в широких пределах в зависимости от того, сколько спирта должно быть в конечном продукте и какова его ожидаемая сладкость. Он может также содержать природные отдушки, масла и т.п. Сахар присутствует в концентрации от по крайней мере 1 мас. до количества, способного ингибировать ферментационную функцию (например, 30-40 мас.), предпочтительно 4-25 мас. относительно общего веса среды.

Объемная скорость подачи водного субстрата через колонку является важным параметром, поскольку производительность по этанолу зависит от объемной скорости. Было также показано, что объемная скорость определяет число дрожжевых клеток, которые остаются связанными с носителем. При высоких объемных скоростях отходящий поток дрожжевых клеток увеличивается, следовательно, производительность по этанолу может также зависеть от числа клеток, связанных в иммобилизованной системой, а не только от общей скорости субстрата. Если объемная скорость слишком велика, то производство эталона будет незавершенным и/или неполным; путем регулирования объемной скорости можно контролировать концентрацию этанола, обычно в пределах 0,05-15 об. относительно общего объема водного субстрата. Регулируя значение объемной скорости, можно получить концентрацию этанола в указанном выше интервале.

Количество дрожжевых клеток, остающихся связанными с носителем, по-видимому является относительно стабильным при низких объемных скоростях, что предполагает сбалансированность роста дрожжей и выщелачивание клеток. При более высоких объемных скоростях степень выщелачивания повышается, однако число клеток снова возвращается к нормальному уровню при уменьшении объемной скорости. Объемная скорость должна иметь достаточно высокое значение для того, чтобы обеспечить выщелачивание мертвых клеток с тем, чтобы избежать автолизиса. В ходе работы колонны с иммобилизованными дрожжами, дрожжи поддерживаются в жизнеспособном состоянии в помощью способных к ферментации сахаров в водном субстрате.

Колонка с иммобилизованными дрожжами может работать, как указывалось выше, под давлением. Рабочее давление должно быть достаточно высоким для того, чтобы диоксид углерода сохранялся в растворенном состоянии и для того, чтобы избежать возможного каналового эффекта при прохождении пузырьков СО₂ через колонну с иммобилизованными дрожжами. Типичное значение давления составляет 14 бар.

Подходящая температура имеет значения, которые используются в традиционных способах периодической ферментации. Эти значения лежат в интервале 0-40^оС, предпочтительно 10-35^оС. Такие температуры могут поддерживаться либо нагреванием колонн с помощью обогревательных рубашек, или путем установки колонн в помещении, температура в которых регулируется на значении температуры окружающего воздуха, либо в результате охлаждения. Разумеется, дрожжи также выделяют некоторое количество тепла, и это обстоятельство может быть с успехом использовано. Значение давления выбирают в соответствии со значением рабочей температуры.

После ферментации элюированный этанольный продукт охлаждают до температуры хранения и собирают в буферный резервуар для общепринятой послеферментационной обработки, например фильтрации, пастеризации и упаковки.

Описанная выше система производства этанола является более быстродействующей и более удобной, чем системы, используемые в традиционных способах ферментации, и в ней производится продукт с приемлемым вкусом, эквивалентным вкусу, получаемому в традиционных способах ферментации. Время, необходимое для ферментации, согласно способу изобретения сокращается от недель до нескольких часов, что совместно с непрерывной природой процесса создает большой потенциал в отношении экономии времени и денег при промышленном производстве спирта и спиртовых напитков.

Следующие ниже примеры дополнительно иллюстрируют многие аспекты предлагаемого изобретения. Однако эти примеры не ограничивают и не характеризуют изобретение, поскольку оно было полностью охарактеризовано выше.

П р и м е р 1. Подготовка колонного реактора.

В качестве носителя использовали гранулярную ДЕАЕ-целлюлозу (GDC), выпускаемую по патенту США N 4 355 117 компанией Finnish Sugar Co, Ltd, с размером частиц 315-840 мкм или 470-840 мкм. Во всех экспериментах носитель заполняли, стерилизовали и иммобилизировали на нем дрожжи согласно следующей методике в случае использования GDС.

Изображенный на чертеже сосуд 1 гидратации вначале наполовину заполняли водой. Включали мешалку и в сосуд 1 переносили сухой носитель (GDC). После завершения гидратации (около 5 ч) реактор 2 с иммобилизованными дрожжами заполняли наполовину водой и водную суспензию носителя из гидратационного сосуда 1 переносили в реактор 2. Для поддержания уровня воды в реакторе клапан на дне реакторе устанавливали в таком положении, что входящий поток и выходящий поток из реактора были одинаковыми. Затем носитель в реакторе стерилизовали горячей разбавленной едкой щелочью 3 путем прокачивания ее через реактор 2. Затем слой носителя прополаскивали водой и нейтрализовали путем прокачивания подходящей разбавленной кислоты 4 через слой носителя в реакторе 2, и наконец слой носителя ополаскивали стерильной водой.

Дрожжевую суспензию готовили в сосуде 5. Затем дрожжевую суспензию прокачивали через слой носителя в течение 1-4 ч и дрожжи абсорбировались на носитель. После этого дрожжи были иммобилизованы на носителе. Реактор 2 в основном готов к ферментации.

П р и м е р 2. Ферментация яблочного сока.

Дрожжи культивировали также, как и при периодической ферментации, и готовили слои носителя объемом 500 мл каждый, используя дрожжевые клетки в количестве, указанном в примере 1.

Носитель имел размер частиц 0,315-0,840 мм.

Сразу после адсорбции дрожжей на слой носителя в колонне (диаметр 50 мм и высота 250-300 мм) начинали подавать субстрат с объемной скоростью порядка 1 объем слоя/день. В качестве субстрата использовали пастеризованный яблочный сок, куда добавляли в количестве 1 г/л фосфат аммония в качестве питательного вещества для дрожжей. Общую концентрацию сахара устанавливали равной 220 г/л путем добавления к яблочному соку сахара. Медленно начинали ферментацию, и через 3 недели уровень содержания этанола составлял 4,5%
П р и м е р 3. Повторяли методику примера 2 с использованием колонки, загруженной носителем, с размером частиц 0,470-0,840 мм. Через 50 дней работы объемную скорость снижали до значения 0,8 объема слоя/день, что немедленно повышало уровень содержания этанола в течение последующей недели от 5 до 7-8%
П р и м е р 4. Повторяли методику, описанную в примере 3, с использованием колонн, которая была шире и короче (диаметр 75 мм, высота 152 мм). После стерилизации, промывки и нейтрализации (метабисульфит натрия) слоя носителя иммобилизацию дрожжей проводили при существенно более высокой концентрации дрожжевых клеток, на 500 мл GDC использовали 600 мл суспензии дрожжей, которая содержала 150 млн. клеток/мл. Утечка через колонну составила 5 млн. клеток/мл, поэтому общее иммобилизованное количество составило 9 х 10¹⁰ клеток. Это составляет 2 х 10⁹ клеток/мл GDC или 5 х 10⁹ клеток/г GDC.

Перед подачей яблочного сока колонку в течение дня обрабатывали раствором субстрата, содержащим дрожжевые питательные вещества. Ферментацию начинали быстро по сравнению с методиками примера 2 и 3, и на второй день уровень содержания этанола составил уже 8% Объемная скорость составила 1 объем слоя/день, а уровень содержания питательных веществ 1 г/л сока. Некоторое количество материала также терялось из колонки с флегмой из диоксида углерода.

Уменьшение скорости подачи через 3 недели снова вызывало повышение содержания уровня спирта. Через 1,5 месяца уровень содержания питательных веществ повышается до 2 г/л, что приводило к дополнительному повышению уровня содержания спирта и система стабилизировалась на уровне содержания этанола 10% в ходе третьего месяца ее эксплуатации.

П р и м е р 5. Повторяли методику, описанную в примере 4, используя реактор объемом 8 л. Реактор был сконструирован таким образом, что на выходной линии имелась сетчатая пластина, удерживающая частицы GDС. Система стабилизировалась на уровне содержания этанола 10% в течение недели. Часть продукта из восьмилитрового реактора подавали во вторую колонку емкостью 500 мл с целью повышения уровня содержания этанола.

Все эксперименты проводили при комнатной температуре (20-23^оС). В этом случае, когда второй реактор работал под давлением, достаточно высоким для удержания диоксида углерода в растворенном состоянии, получали игристый продукт типа шампанского, который при бутилировании под тем же давлением, что использовали при ферментации, не требовал второй ферментации (в бутылках), что позволяло упростить процесс приготовления шампанского.

П р и м е р 6. Первичная ферментация пива.

Подготовку колонки и иммобилизацию дрожжей проводили согласно методике, описанной в примере 1. Слой носителя объемом 500 мл загружали в стеклянную колонку с расширенным верхним концом с тем, чтобы облегчить отделение диоксида углерода. Сусло подавали со дна ферментационной колонки. Концентрацию дрожжевых клеток устанавливали равной 10⁹ клеток/г GDC.

В качестве сырья использовали традиционное сусло для варки пива Лагер. Сусло готовили из 18 кг ячменного солода (типа Пилснер), что давало конечный объем сусла 100 л (12,0 ^оp). Смесь воды и солода заваривали в одном сосуде согласно методу программированного вливания при изменении температуре по следующей программе: 48^оС в течение 15 мин, 63^оС в течение 30 мин, 72^оС в течение 20 мин и 78^оС в конце варки.

Сусло осветляли в фильтрационной бочке и дважды прополаскивали водой с температурой 78^оС. Сусло кипятили в котле в течение 90 мин. Вначале варки добавляли чешуйки хмеля (общее количество альфа-кислот 10 г). Осадок, образовавшийся в ходе варки, отделяли в вихревом отстойнике. Осветленное сусло охлаждали на плоском теплообменнике от 100 до 10^оС.

Сусло имело следующий состав:
Исходный экстракт, ^оПлато 12,0
Цвет, ^оЕВС 10,0
Горечь, ЕВУ 25
рН 5,3
Кажущаяся степень разбавления, 85
Однако состав сусла может меняться следующим образом:
Исходный экстракт, ^оПлато 6-18
Кажущаяся степень
разбавления, 65-100
Ферментацию сусла в реакторной колонке начинали медленно. После работы в течение недели обеспечивалась скорость, позволяющая получать приемлемое пиво при скорости подачи сырья менее один объем слоя в день. Условия работы колонки были теми же, что и в винных реакторах, описанных в примерах 2 и 3.

П р и м е р 7. Ферментация Саке.

Получали Саке с низким содержанием алкоголя (Японское рисовое вино). Подготовку колонки и иммобилизацию дрожжей проводили по методике, описанной в примере 1.

Для получения субстрата рис вначале ожижали под действием пара и гидролизовали в присутствии альфа-амилазы и амилоглюкозидазы. Полученный в результате гидролизат отфильтровывали с целью удаления всех механических примесей и негидролизованных остатков. После этого субстрат разбавляли таким образом, чтобы концентрация глюкозы составила 23% при ее подаче в колонку. Объем носителя в колонке составлял 500 мл. Диаметр колонки составлял 70 мм, а соотношение диаметр/высота в слое носителя 1:2. Проводили сравнение с действием дрожжей, полученных улавливанием на альгинате Са. В следующей ниже табл.1 приведены значения скоростей подачи, параметров и результаты обеих ферментаций:
П р и м е р 8. Ферментация меда.

Получали мед с низким содержанием спирта (традиционный Скандинавский напиток).

Скорость ферментации регулировали путем контролирования скорости подачи и в результате получали продукт требуемого вкуса и с нужным содержанием спирта.

Подготовку колонки и иммобилизацию дрожжей проводили, следуя методике, описанной в примере 1. Концентрацию дрожжевых клеток поддерживали такой, чтобы обеспечить 10⁹ клеток (GDC).

Водный субстрат для ферментации формировали следующим образом,г:
Кристаллический (белый) сахар 500
Мед 125
Мягкий коричневый сахар 625
Сок двух лимонов
Вода, л 10
Объем носителя в колонке составлял 500 мл. Субстрат подавали со дна колонки. Скорость подачи вначале составила 1 объем слоя за 5-10 ч. После стабилизации ферментации скорость подачи регулировали в пределах 1 объем слоя за 1-5 ч в зависимости от желаемого содержания этанола и сладкости продукта. Содержание этанола в напитке составляло 0,2-2,0 мас./мас. Для поддержания жизнедеятельности дрожжей в качестве питательного вещества добавляли небольшие количества фосфата аммония (10-100 ч/млн.).

Получение продукта осуществляли при комнатной температуре и при значениях других параметров, указанных ниже. Реактор с иммобилизованными дрожжами может также работать под давлением при более низкой температуре. В этом случае образовавшийся диоксид углерода растворяется, и в конечном добавлении его нет необходимости.

Помимо указанного выше субстрата может использоваться и другое сырье. Все такие субстраты, например солод, фрукты и ягоды, содержат способные к ферментации сахара. Вкус конечного продукта будет зависеть от природы сырья, концентрации сахара и скорости ферментации.

П р и м е р 9. Демонстрация иммобилизации дрожжей на некоторых носителях.

Дрожжи Брювера из Коллекции промышленных микроорганизмов Финского технического исследовательского центра (Коллекционный номер А-75050) иммобилизовали на двух смолах с анионообменной функциональностью.

В качестве смол использовали гранулированную ДЕАЕ-целлюлозу с торговым наименованием SPEZYME GDC 220 и синтетическую анионообменную смолу с торговым наименованием ДУОЛИТ А 568.

Иммобилизацию проводили согласно следующей методике.

Дрожжи инкубировали в течение 48 ч в бульоне солодового экстракта при 30^оС. Смолу стерилизовали путем промывки 1М гидроксида натрия, с рН 5,0-5,1 и промывали стерильной водой. Образец смолы весом 10 г в расчете на сухое вещество загружали в стеклянную колонку с внутренним диаметром 20 мм, снабженную на днище стеклянным фильтром. Дрожжевую суспензию в количестве 100 мл пропускали через колонку под действием силы тяжести со скоростью 3 объема слоя/ч, после чего колонку промывали 100 мл стерильной воды.

Концентрацию клеток в дрожжевой суспензии до и после иммобилизации определяли подсчетом на агаровой пластине. По разности определяли число иммобилизованных клеток. Результаты выраженные числом иммобилизованных клеток на 1 г смолы, приведены в табл.2.

П р и м е р 10. Регенерация носителя.

Используемую в экспериментах колонку с ДЕАЕ-целлюлозой регенерировали путем подачи горячего (около 60^оС) раствора каустической соды (2%-ный гидроксид натрия) через колонку до однородного посветления материала. Колонку ополаскивали стерильной водой до тех пор, пока рН промывного раствора не принимал значение 10, и нейтрализовали пиросульфитом натрия до рН 7. Колонку ополаскивали стерильной водой и загружали суслом, содержащим дрожжевые клетки (около 10 клеток/л носителя), клетки выращивали в присутствии аэрированного сусла в течение 24 ч, после чего система была подготовлена к ферментации субстрата.

Формула изобретения

1. Способ получения этанольного продукта, предусматривающий пропускание через по меньшей мере один реактор, содержащий иммобилизованные на носителе дрожжевые клетки, водного сахарсодержащего субстрата и ферментацию его с получением этанольного продукта, отличающийся тем, что в качестве носителя используют носитель, обладающий анионообменными свойствами и представляющий собой сплошную пористую матрицу или шероховатые либо сетчатые пористые частицы, причем матрица или частицы имеют структуру, образованную из свободно связанного множества микрочастиц или микроволокон, которые химически, адгезионно или механически связаны друг с другом по крайней мере в некоторых контактных точках между индивидуальными микрочастицами или микроволокнами.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что микрочастицы или микроволокна, образующие частицы, состоят из анионообменной смолы.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что микрочастицы или микроволокна, состоящие из анионообменной смолы, выбирают из группы, состоящей из природной или регенерированной целлюлозы, дериватизированной для обеспечения анионообменных свойств.

4. Способ по п.1, 2 или 3, отличающийся тем, что носитель представляет собой микроволокна, агломерированные с полистиролом.

5. Способ по п.1, 2 или 3, отличающийся тем, что анионообменная смола представляет собой диэтиламиноэтилензамещенную целлюлозу.

6. Способ по п. 4 или 5, отличающийся тем, что водный сахарсодержащий субстрат пропускают через множество реакторов, соединенных последовательно и снабженных средствами для удаления газа из ферментируемого субстрата.

7. Способ по п. 4 или 5, отличающийся тем, что водный сахарсодержащий субстрат пропускают через реактор под давлением, обеспечивающим поддержание значительной части образовавшегося при ферментации диоксида углерода в растворенном состоянии для получения газированного этанольного продукта.

8. Способ по п. 6 или 7, отличающийся тем, что водный сахарсодержащий субстрат пропускают через реактор в направлении, противоположном действию силы тяжести.

9. Способ по п.6 или 7, отличающийся тем, что периодически изменяют направление движения водного сахарсодержащего субстрата на обратное.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2