Штамм бактерий rhizobium fredii для приготовления бактериального удобрения

 

Использование: сельское хозяйство, производство бактериальных удобрений. Сущность изобретения: штамм бактерий Rhizobium fredeii получен методом рекомбинантныx ДHК на основе реципиентного штамма Rhizobium fredii ВD32. Штамм бактерий Rhizobium fredii В-1980 D обладает повышенной солеустойчивоcтью (до 0,8 М) и повышенным синтезом пролина (до 64,6 н/моль/мг белка). Урожайность растений сои, инокулированных штаммом В-1980D, выше, чем растений, инокулированных известным штаммом BD32, нa 8% по семенам, и на 9% по воздушно-сухой биомассe, соответственно. 4 табл., 1 ил.

Изобретение относится к области сельскoго хозяйства, к приготовлению бактериальных удобрений, и может быть использовано для стимуляции роста и повышения урожайности растений. Известен штамм Rhizobium fredii BD32 ( в кн. "Резервы повышения эффективности соеводства", Новосибирск, 1988, с. 79 89), обеспечивающий высокую урожайность сои в лабораторных условиях, но обладающий низкой осмоустойчивостью и жизнеспособностью в процессе полевых испытаний и поэтому не может быть использован для приготовления из него бактериального удобрения.

Техническим результатом от использования изобретения является конструирование нового штамма Rhizobium fredii B 1980D, применяемого для приготовления бактериального удобрения.

Новый штамм R.fredii В-1980D характеризуется следующими особенностями.

Это грамотрицательные подвижные палочки размером 0,5-0,9 х 1,2 3,0 мим, обладающие жгутиками. Клетки данного штамма содержат плазмиду pNSA. Плазмида кодирует детерминанты устойчивости к канамицину и ампициллину.

Клетки хорошо растут на среде TY ( 1г дрожжевого экстракта, 10 г бактотриптона; 0,1г хлористого кальция на 1л ), а также на минимальной и богатой синтетической среде Р1 ( 2г маннитол, 5г KH₂PO₄; 0,1г CaCl₂; 0,01г Na₂MО₄·2Н₂О; 1,5г биотина; З0 мг тиаминHCl; 0,1г MgSО₄·7Н₂О, 4г лейцина; 1г дрожжевого экстракта на 1л ).

Морфология колоний на агаризованных средах ( при 30^oC на 2-3 день ): колонии гладкие, беловатые, покрытые небольшим количеством слизи, диаметром 2-3 мм, при более длительном культивировании колонии сливаются в сплошной газон.

Физиологo-биохимические свойства.

строгий аэроб, метаболизм глюкозы окислительный. В факторах роста не нуждается.

Оптимальная температура роста на питательных средах pавна 23-30^oС. Хорошо растет при pН 7,5-8,0.

В качестве единственного источника углерода усваивает с образованием кислоты глюкозу, маннитол, арабилозу, сахарозу, рафинозу, сукцинат, бензоат, протокатехат и катехол. При росте на плотных средах, содержащих в качестве источника углерода сахара, образует слизистые колонии.

Из источников азота лучше использует нитратную форму, чем аммонийную.

Штамм R.fredii В-1980 обладает повышенной солеустойчивостью (до 0,8 М) и характеризуется повышенным синтезом пролина (до 64,6 н/моль/мг белка).

Исходный штамм Rhizobium fredii BD32 был выдeлeн в 1987 г. из корневых клубеньков растений сои Clicyneu soja сорта "Октябрь 70", произрастающих на плантациях Института сои РАСХН в г.Блоговещенске Амурской области. Штамм был охарактеризован по целому ряду параметров, в том числе по скорости роста, солеустойчивости и устойчивости к антибиотикам. Было установлено, что клетки данного штамма относятся к быстрорастущим ризобиям, обладают низкой солеустойчивостью, устойчивостью к канамицилу ( до 12 мг/мл ) и чувствительны к ампициллину и тетрациклину. Штамм был испытан на плантациях сои в Крыму и в Амурской области. Применений данного штамма в Крыму дало увеличение урожая сои на 60-70% Однако использование его в Амурской области, где почвы являются более засоленными, оказалось не эффективным.

Согласно изобретению сконструирована гибридная плазмида рNSA, обеспечивающая повышенный синтез пролина и осмоустойчивость клеток; данная плазмида введeна в клетки ризобий Rhizobium fredii BD32, в результате получен новый рекомбинантный штамм Rhizobium fredii B-1980D; проведена нодуляция рaстений сои данным рекомбинантным штаммом.

На Фиг. представлен график потребления воды растениями сои инокулированными различными штаммами Rhizobium.

Получение рекомбинантного штамма R. fredii B-1980D и его свойства иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. Конструирование штамма Rhizobium fredii B-1980D. Штамм R. fredii B-1989D получен путем введения плазмиды рNSA в клетки R.fredii BD32, которое осущeствляли с помощью конъюгации с использованием плазмиды-помощника pRК2013. Для этого 100 мкл ночной культуры клеток Е. соli HB101/рNSA и 100 мкл ночной культуры Е. соli HB 101/рRK2013 сливали с 500 мкл ночной культуры R.fredii BD32. Смесь клеток концентрировали до 100 мкл в среде TY ( 1г дрожжевого экстракта. 10г бактотринтона, Iг хлористого кальция на 1л ) и выливали на чашку Петри с агаризованной средой TY без антибиотика. Через сутки выросшие колонии смывали жидкой средой TY в объеме 1мл, концентрировали до 0,1мл и рассеивали на чашки Петри с агаризованной средой TY, содержащей ампициллин 100 мкг. Выросшие клоны R.fredii BD32 содержат плазмиду pNSA.

Нативность плазмиды pNSA после переноса в клетки ризобий определяли путем ее выделения и физического картирования, Hаличие оперена proB_ostprоA в составе плазмиды pNSA, перенесенной в Rhizobium fredii BD32, определяли с помещиц ДНК-ДНКблоттинг-гибридизации. Полученные данные позволяют утверждать, что плазмида рNSA перенесена в клетки ризобий в нативном виде.

Пример 2. Определение солеустойчивости бактерий Rhizobium fredii В-1980D.

Определение солеустойчивости бактерий R.fredii B-1980D проводили в среде P1M (KH₂PO₄ 0,5г; NaHPO₄ 0,5г, CaCl₂ 0,07; Na₂MoO₄ x 2H₂O 0,07г; маннит 2г, MgSO₄ 0,01, биотин 0,015 г; тиамин 0,03, H₂O до 1л,pH 7,0 ) с концeнтрaцией NaCl 0,4; 0,6 и 0,8 М. Клетки растили в течение 5 суток при 30^oС. Результаты экспериментов указаны в табл.1.

Увеличение количества клеток в процессе роста бакториальной культуры определяли измерением поглощения с помощью фотоэкспонометра. Измерение проводили при зеленом фильтре в кювете объемом 1 мл через каждые 4 часа. Определение скорости роста клеток проводили в логарифмической фазе роста во временном интервале, в течение которого происходит удвоение числа клеток, согласно методу, описанному в ( "Эксперименты в молекулярной генетики" М, "Мир", 1976, стр135 ). Результаты экспериментов показывают, что осмоустойчивость клеток Л. fredii D-1980D выше осмоустойчивости клеток природного штамма ВD32.

Пример 3. Штамм R. fredii B-1980D выращивали на косяках агаризованной среды Р1 с добавкой антибиотиков. Клетки смывали с косяка стерильной средой Р1М и готовили суспензию, содержащую 10⁹ клеток в 1 мл жидкости. Приготовленную бактериальную суспензию использовали как препарат бактериального удобрения, (суспензию можно использовать после ее нанесения на носитель ( торф, oпилки и т.д.).

Пример 4. Использование нового штамма бактерий Rhizobium fredii В-1980D в качестве бактериального удобрения для растений сои.

Влияние бактерий R. fredii В-1980D на инокулированные ими растения сои Glicyneu soja определяли по таким параметрам как скорость созревания, поглощение воды и урожайность. Сравнения проводили с растениями сои,инокулированной штаммами R.fregii BD32 дикого типа. Семена сои вымачивали в течение 1 недели в стерильной H₂O. Проростки высаживали в рассадный ящик со стерильной почвой и выращивали растения до первого листа. Растения одинакового размера высаживали по одному в горшки объемом 1 л со стерильной почвой. Поливали растения стерильной водой. Влажность почвы доводили до 80% которая является оптимальной для вегитационных опытов. Полив проводили раз в 3 дня.

Инокуляцию растений проводили введением бактерий в лунку в почве.

Перед поливом горшки с растениями взвешивали. Во время полива каждый раз влажность почвы доводили до 80% и замеряли израсходованный объем воды. Наблюдение вели в течение 50 дней. Результаты измерения потреблений воды растениями, инокулированными различными штаммами бактерий, показаны на фиг. На графике видно, что до начала цветения употребление воды растениями, инокулированными штаммом В-1980D, резко снижено по сравнению с растениями, инокулированными штаммами и BD33. С началом цветения потреблeниe воды инокулированными растениями возрастает, особенно рaстениями, инокулированными штаммом В-1980D. В целом потребление воды на 1 г воздушно-сухой биомассы растениями, инокулированными штаммом B-1980D, на 2% ниже, чем растениями, инокулированными штаммом ВD32, в процентном отношении к среднему уровню.

Данные об урожайности семян и воздушно-сухой биомассы нa сосуд представлены в табл.2. Из этих данных видно, что урожайность растений сои, инокулированных новым штаммом R-1980D, выше, чем растений, инокулированных известным BD32 на 8% по семенам, и на 9% по воздушно-сухой биомассе, соответственно.

Пример 5. Изучили способность к синтезу пролина у нового штамма Рh fredii В-1980D и у исходного дикого штамма Rh fredii ВДЗ2. При росте на среде Р1М с 0,04 М NaCl новый штамм накапливает в среде пролин в количестве до 64,6 нмоль/мг белка, в то время как дикий штамм накапливает пролин в этих условиях только до 5,8 нмоль/мг белка. На среде Р1М без NaCl новый штамм накапливает в среде пролин в количестве до 50 нг/мл.

Пример 6. В связи с выявленной способностью нового штамма синтезировать и накапливать в среде в больших дозах пролин, который может служить источником питания для корневой системы иных кроме сои растений, изучили влияние нового и известного штаммов на прорастание семян озимой пшеницы и томата.

В чашки Петри помещали фильтровальную бумагу и смачивали ее суспензией бактерий в водопроводной воде, содержащей 5х10 8 клеток/мл. В контроле фильтровальную бумагу смачивали водой водопроводной.

На увлажненную поверхность фильтровальной бумаги помещали семена исследуемых видов растений по 100 шт. на чашку Петри. Чашки с семенами помещали в термостат (37^oС), инкубация продолжалась 10 дней, учет результатов производили на 4-й и на 10-й дни инкубации. Результаты приведены в таблицах 3 и 4.

Приведенные данные свидетельствуют об ускорении прорастания семян исследуемых культур растений в присутствии вида Rh fredii причем новый штамм оказывает более выраженное действие, чем исходный дикий штамм.

Таким образом, новый штамм может быть рекомендован для промышленного получения и использования в качестве удобрения. ТТТ1

Формула изобретения

Штамм бактерий Rhizobium fredii В-1980D для приготовления бактериального удобрения.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4