Штамм бактерий corynebacterium sp. - продуцент l-лейцина

 

Использование: микробиология, биотехнология. Сущность изобретения: селекционным путем получен штамм Corunebacterium sp продуцент незаменимой аминокислоты L-лейцина. Штамм устойчив к S=(2-аминоэтил)=цистеину, D, L = 4-гидроксилейцину и рифампицину и позволяет получать на средах, содержащих в качестве источника углерода мелассу, до 23,7 г/л лейцина. Изобретение содержит данные о свойствах штамма, а также описаны условия накопления L- лейцина в аппаратах большой емкости (100 куб.м). 1 табл.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий-продуцента L-лейцина, незаменимой аминокислоты, которую используют в качестве питательной добавки к пищевым продуктам и к кормам животных, а также как компонент питательных смесей и реактивов в медицинской, фармацевтической и химической промышленности.

Известные микробиологические способы получения лейцина основаны на использовании мутантов с нарушенной регуляцией биосинтеза аминокислот. Мутанты характеризуются устойчивостью к различным структурным аналогам аминокислот, а также, во многих случаях, потребностью для роста в аминокислотах. В этих способах в качестве продуцентов лейцина применяют мутантные штаммы группы глутаматпродуцирующих коринебактерий: Corynebacterium glutamicum (патент США 3668073), Brevibacterium flavum (патент США 3865690, авт.свидетельство СССР 583641 и 1394711), Brevibacterium lactofermentum (патент США 3970519). Наиболее высокий уровень накопления лейцина (34 г/л) получен при использовании ауксотрофного по изолейцину и метионину аналогорезистентного штамма Brevibacterium lactofermentum на среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу (Appl.Env.Microbiol. 54, 1024, 1986).

При получении лейцина микробиологическим способом в питательных средах в качестве источника углеводов в основном используют глюкозу, сахарозу, сахар-сырец (патент США 3668073, 3970519, авт.свидетельство СССР 1394711). Известен также способ, предусматривающий мелассу в качестве источника углеводов с использованием штамма Brevibacterium lactofermentum АТСС 21888 (патент США 3959075). Уровень накопления лейцина составлял 15,8 г/л.

Задачей изобретения является создание нового штамма бактерий, продуцирующего лейцин в высоких концентрациях на ферментационных средах, содержащих в качестве источника углерода мелассу.

Предлагаемый новый штамм Corynebacterium sp. ВНИИгенетика-127 за 60-72 ч накапливает на среде с мелассой лейцин в концентрации до 23,7 г/л. Новый штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов и имеет регистрационный номер ВКПМ В-5803.

Новый штамм получен из лейцинпродуцирующего штамма Corynebacterium sp. ВКПМ B 5572 следующим образом. На первом этапе от исходного штамма В-5572 были получены спонтанные мутанты, резистентные к рифампицину (30 мкг/мл), среди которых был отобран штамм 40, характеризующийся наибольшей продукцией лейцина (8-10 г/л). Затем клетки штамма 40 были обработаны N-метил-N-нитро-N-нитрозогуанидином (200 мкг/мл, 30 мин) и высеяны на минимальную агаризованную среду, содержащую аналог лейцина D,L-4-гидроксилейцин в концентрации 5 мг/мл. После проверки полученных аналогорезистентных мутантов на способность к накоплению лейцина на средах, содержащих мелассу в качестве источника углерода, был отобран штамм Corynebacterium sp. ВНИИгенетика-127.

Новый штамм Corynebacterium sp. ВНИИ генетика-127 имеет следующие культурально-морфологические признаки.

Культурально-морфологические признаки. Клетки овальные, размеры 1,5-4,0х0,5-1,0 мкм, неподвижные, грамположительные, спор не образуют.

Через 3-5 сут роста при 30^oС на МПА и на агаре Хоттингера колонии диаметром 1-3 мм, светло-кремовые, поверхность гладкая, форма выпуклая, край ровный, структура однородная тестообразная. При посеве штрихом через 2 сут рост умеренный, край гладкий, поверхность матовая. При посеве уколом рост в глубине агара слабый, на поверхности умеренный.

Через 3-5 сут роста при 30^oС на глюкозо-минеральной среде Гловера, содержащей биотин и тиамин, колонии 1-2 мм, край ровный, структура однородная, консистенция тестообразная, поверхность гладкая, цвет колоний белый. Рост штриха на этой среде через 2 сут умеренный.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Желатину не разжижает.

Хорошо растет на глюкозе, сахарозе, мальтозе, фруктозе, маннозе, этаноле, уксусной кислоте. Не растет на ксилозе, арабинозе, лактозе. Усваивает азот в форме солей аммония и мочевины. Не усваивает нитратный азот.

Растет при температуре 24-42^оС. Оптимальная температура 32^оС.

Растет на средах с рН от 6 до 8,5. Оптимальное значение рН 6,8-7,2.

Для роста в минимальной среде нуждается в биотине, тиамине.

Устойчив к аналогу лизина S-(2-аминоэтил)-цистеину (АЭЦ), аналогу лейцина DL-4-гидроксилейцину и антибиотику рифампицину.

Штамм хранится при температуре 4^oС на косяках с агаром Хоттингера в течение 3 месяцев или в лиофильно высушенных ампулах в течение 1 года.

Новый штамм В-5803 характеризуется изменением свойств ключевых ферментов, важных для продукции лейцина. Активность изопропилмалатсинтетазы нового штамма (табл. 1) повышена в два раза по сравнению с активностью этого фермента исходного и более чем в 4 раза выше, чем у штамма-прототипа. Данный фермент практически не ингибируется лейцином, как и штамма-прототипа. В то же время фермент родительского штамма подвержен ингибированию лейцином.

Удельная активность и чувствительность к ингибированию лейцином изопропилмалатсинтетазы у нового штамма, его родительского штамма и штамма-прототипа даны в таблице.

Получение лейцина с использованием штамма Corynebacterium sp. В-5803 осуществляется следующим образом. Клетки штамма выращивают на агаризованной полноценной среде, затем засевают колбы с посевной средой. Колбы устанавливают на круговую качалку (220-250 об/мин) и инкубируют в течение 20-24 ч при 30-32^оС. Выращенный посевной материал вносят в колбы или ферменты с ферментационной средой, содержащей источник углерода, азота, витамины и минеральные соли. Все компоненты среды стерилизуют под давлением. Ферментацию проводят в колбах или ферментере, оборудованном системой перемешивания и аэрирования, при 30-32^оС в течение 60-72 ч. Концентрация лейцина в культуральной жидкости достигает 23,7 г/л.

Лейцинсодержащая культуральная жидкость может использоваться в качестве добавки к ферментационным средам при производстве L-лизина с использованием штаммов-продуцентов, нуждающихся для роста в лейцине. Препарат кристаллического лейцина получают из ферментационного раствора известными способами.

П р и м е р 1. Культуру штамма Corynebacterium sp. ВКПМ В-5803 выращивают в течение 24 ч при 30^оС на мясо-пептонном агаре. Петлей засевают 50 мл посевной среды, помещенной в колбы на 750 мл. Состав посевной среды, меласса 4,0; кукурузный экстракт 4,0; сернокислый аммоний 1,0; мел 1,0, рН среды 7,2. Колбы инкубируют на круговой качалке (250 об/мин) при температуре 32^оС в течение 22 ч. Приготовленным таким способом посевным материалом в количестве 5% по объему от объема ферментационной среды засевают колбы на 250 мл, содержащие 10 мл ферментационной среды следующего состава, меласса 27; сернокислый аммоний 2,5; однозамещенный фосфорнокислый калий 0,15; сернокислый магний 0,05; мел 2,5; тиамин 0,0002; дестиобиотин 0,0002. Ферментацию проводят на круговой качалке (250 об/мин) при 32^оС в течение 72 ч. К концу ферментации накапливается лейцин в концентрации 23,5 г/л. Штамм-прототип Brevibacterium flavum ВКПМ В-2736 в этих условиях накапливает лейцин в концентрации 13,0 г/л.

П р и м е р 2. Посевной материал штамма Corynebacterium sp. ВКПМ В-5803 готовят по примеру 1, но в составе посевной среды вместо сернокислого аммония используют хлористый аммоний в концентрации 0,8% а концентрация кукурузного экстракта увеличена до 8% Посевным материалом в количестве 5% по объему засевают лабораторный фермент, содержащий 1,6 л ферментационной среды следующего состава, меласса 20; хлористый аммоний 1,0; двузамещенный фосфорнокислый аммоний 0,2; сернокислый магний семиводный 0,05; тиамин 0,0001; дестиобиотин 0,0001 (рН 7,6). Процесс ферментации проводят при 32^оС, скорость вращения мешалки 800 об/мин, подача воздуха 0,5 объема на объем среды в мин. Через 10 ч ферментации подачу воздуха увеличивают до 1,0 объема на объем среды в мин. Значения рН среды поддерживают в пределах 7,0-7,4 автоматически, подавая по сигналу датчика рН 12,5% -ный раствор аммиака. Через 26 ч после начала ферментации производят подачу 70%-ного раствора мелассы со скоростью 15 мл/ч. Через 69 ч концентрация L-лейцина достигает 22,5 г/л.

П р и м е р 3. Посевной материал штамма Corynebacterium sp. ВКПМ В-5803, приготовленный по примеру 1, вносят в объеме 2 л 5 м³ посевной среды (рН 7,5), содержащей мелассу (200 кг), гидролизат кукурузного экстракта (250 кг), дестиобиотин (0,5 г) и помещенной в ферментер на 10 м³. Ферментер оборудован барбатером для распределения воздуха. Выращивание культуры проводят при 30-32^оС в течение 26 ч с непрерывной подачей воздуха со скоростью 1 объем воздуха на объем среды в мин.

Выращенной культурой засевают 50 м³ ферментационной среды, приготовленной в ферментере на 100 м³, оборудованным барботером для распределения воздуха. Состав ферментационной среды (рН 7,0) меласса (12 т), хлористый аммоний (450 кг), двузамещенный фосфорнокислый аммоний (90 кг), дестиобиотин и тиамин (по 5 г). Значения рН среды в ходе ферментации поддерживают в пределах 6,8-7,0 автоматически, подавая по сигналу датчика рН насыщенный раствор аммиака. Скорость подачи воздуха 1 объем на объем среды в мин. При снижении концентрации сахаров до 3% производят подпитку со скоростью 0,4-0,5 м³/ч. Состав подпитки, меласса 65; хлористый аммоний 0,5. Общий объем подпитки 20 м³.

Через 60 ч ферментации концентрация лейцина составляет 23,7 г/л. Штамм-прототип Brevibacterium flavum ВКПМ В-2736 в тех условиях ферментации за 72 ч культивирования накапливает лейцин в концентрации 14 г/л.

Таким образом, новый штамм Corynebacterium sp. ВКПМ В-5803 позволяет достигать высокого уровня накопления лейцина (23,7 г/л) в промышленных условиях при использовании простых по составу и относительно дешевых питательных сред, содержащих мелассу в качестве углерода.

Формула изобретения

Штамм бактерий Corynebacterium sp. ВКПМ В-5803 продуцент L-лейцина.

РИСУНКИ

Рисунок 1