Синтетический полипептид, способ получения и средство для культивирования на его основе

 

Изобретение относится к экспериментальной и клинической гематологии, иммунологии, патофизиологии, биохимии, онкологии, радиационной медицине и может быть использовано в медико-биологических исследованиях для культивирования предшественников гранулоцитов, макрофагов. Предлагается использовать для культивирования предшественников гранулоцитов и макрофагов низкомолекулярные синтетические пептиды с молекулярной массой около 1500 дальтон следующей структуры: LYS GLY PRO LEY THR NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO или THR NLE NLE ALA SER HIS TYS LYS GLN HIS CYS PRO, соответствующие участкам структуры природного белка. Синтез заявляемых пептидов осуществляют твердофазным методом.

Изобретение относится к экспериментальной и клинической гематологии, иммунологии, патофизиологии, биохимии, онкологии, радиационной медицине и может быть использовано в медико-биологических исследованиях для культивирования предшественников гранулоцитов, макрофагов, для диагностики миелодиспластических состояний (лейкозов, лейкопений, и других состояний, связанных с депрессией кроветворения), а также для выращивания клеток костного мозга и трансплантации последнего больным с аплазией костномозговых клеток.

Известно средство, применяемое для культивирования предшественников гранулоцитов и макрофагов, в частности для культивирования костномозговых клеток у больных с миелобластным лейкозом, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ), представляющий собой регуляторный белок с молекулярной массой около 15000 дальтон, включающийся в лейкопоэз клеток-предшественников гранулоцитов и макрофагов (Itsuro Jinnai, In vitro growth respоnse to G-CSF GM-CSF by bone marrow cells of patients with acute myeloid leukemia. LEUKEMIA RESEARCH, 1990; v.14, No 3, p. 227-240).

Существенным недостатком известного средства является сложность получения нативного ГМ-КСФ. Использование же рекомбинантного фактора требует длительной и трудоемкой, следовательно, дорогостоящей очистки от примесей бактериальных продуктов, что усложняет и удорожает производство факторов для культивирования предшественников гранулоцитов и макрофагов. При этом могут измениться свойства рекомбинантного фактора по сравнению с нативным. Кроме того, как показали исследования авторов, цельная молекула колониестимулирующего фактора не обладает достаточной селективностью действия: помимо специфических рецепторов, отвечающих за пролиферации клеток, она вовлекает в активацию и другие рецепторы, способные модифицировать ответ полипотентных клеток в сторону снижения или увеличения колониеобразования.

Предлагается использовать для культивирования предшественников гранулоцитов и макрофагов низкомолекулярные синтетические пептиды с молекулярной массой приблизительно 1100 1500 дальтон следующей структуры: LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO или THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO.

Более высокомолекулярные полипептиды отличаются от более коротких тем, что они дополнительно содержат аминокислотные остатки из группы лизин-глицин-пролин-лейцин в последовательности от одного до четырех, вплоть до полипептида по формуле LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO. Причем полипептидная цепь эаявляемых объектов содержит не менее одиннадцати аминокислотных остатков, начиная с любого из данной последовательности.

Синтез предлагаемых пептидов осуществляют твердофазным методом на пептидном синтезаторе "Biosearch 9500". В качестве носителя используют аминометилированный сополимер полистирола и дивинилбензола с нагрузкой аминогрупп 0,6 ммоль/г. Синтез осуществляют методом последовательного наращивания цепи по модернизированной компьютерной программе для синтезатора "Blosearch 9500" с добавлением N-метилморфолина в конденсирующую смесь в отличие от прототипа (Таm J.P. Merrifleld R.B. Int. J. Peptide protein Res. 1985, 26, p.262-273), что позволяет сократить время конденсации и уменьшить расход аминокислот. Для посадки первой аминокислоты используют ее n-оксиметилфенилацетамидометильное производное(Тam) J.Р. Kent S.B. Merrifield R.B. Synthesis, 1979, p. 955-957). Для временной защиты аминогруппы применяют Вос-группу. Боковые функциональные группы защищают Ser, Thr- Bzl; Lys ClZ: Туг С12Вz1 His Воm; Ser MeBzl. Конденсацию проводят карбодиимидным методом с использованием диизопропилкарбодиимида и добавлением 1- гидроксибензотриазола при присоединении Gin, Lys, СIу, His. Деблокирование аминогрупп в процессе синтеза проводят трифторуксусной кислотой, а нейтрализацию раствором диизопропилэтиламина в диметилформамиде. Пептиды снимают сo смолы и деблокируют жидким фтористым водородом с добавлением п-крезола. Деблокированные пептиды очищают с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте трифторацетат/вода-ацетонитрил. Полипептиды характеризуют аналитической ВЭЖХ, аминокислотным анализом и FАБ- массспектрометрией.

Как показали проведенные исследования, вновь синтезированные пептиды оказывают на культивируемые клетки действие, аналогичное действию цельной молекулы ГМ-КСФ (см.табл.1,4),что и позволило предложить их в качестве средства для культивирования предшественников гранулоцитов и макрофагов.

Предлагаемые пептиды воспроизводят фрагменты структуры природного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора. Однако трудно было предположить, что синтетический пептид, по молекулярной массе составляющий лишь 1/10 часть полной молекулы ГМКСФ, будет обладать ярко выраженными свойствами, присущими природному ГМ-КСФ, тем более что в организме человека синтезированные пептиды не определяются в виде активной биологической субстанции, и расщепление по стандартным точкам действия протеолитических ферментов не выщепляет данную структуру. Таким образом заявляемый объект, не следуя явным образом из уровня техники, имеет изобретательский шаг.

Получение синтетической низкомолекулярной молекулы белка, являющейся фрагментом структуры ГМ-КСФ, процесс значительно менее дорогостоящий, чем получение нативного ГМ-КСФ из стимулированных фитогемагглютинином лейкоцитов костного мозга, в то же время чистота получаемого целевого продукта неизмеримо выше по сравнению с рекомбинантным ГМ-КСФ, что определяется технологией получения синтетического пептида. (Vadham-Raj 5. Heating М. Le Malstre А. et al. Effects of recombinant human gtanulocyte-macrophage colony stimulating factor in patients with myelodlsplastlc syndromes. NEW ENGL. J. MED.1987, V. 317, p. 1545) Следует отметить также, что заявляемый объект и ГМ-КСФ оказывают аналогичное действие при эквимолярных соотношениях, однако весового количества предлагаемо го средства требуется на порядок меньше - мол.масса ГМ-КСФ 15000 дальтон, предлагаемых пептидов приблизительно 1100 - 1500 дальтон.

Использование заявляемых пептидов позволяет стимулировать дифференцировку клеток через специфические рецепторы к ГМ-КСФ, не затрагивая другие рецепторы поверхности клеток, что связано с минимальной величиной молекулярной массы пептида. Следовательно,заявляемый объект обладает повышенной избирательностью действия по сравнению с полной молекулой ГМ-КСФ.

Действие заявляемых пептидов на кластеро- и колониеобразование клеток крови изучали в двух моделях: культивирование в диффузионных камерах "in vivo", культивирование "in vitro" в агарозных культурах на планшетах.

Пример 1. Полипептид по формуле THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO (приблизительно 1100 дальтон) синтезировали твердофазным методом на пептидном синтезаторе "Blosearch 9500". В качестве носителя использовали аминометилированный сополимер полистирола и 1% дивинилбензола с нагрузкой аминогрупп 0,6 ммоль/г. Синтез осуществляли методом последовательного наращивания цепи по модернизированной компьютерной программе для синтезатора "Blosearch-9500" с добавлением N-метилморфолина в конденсирующую смесь. Для посадки первой аминокислоты использовали ее n-оксиметилфенилацетамидометильное производное. Для временной защиты аминогруппы применяли Вос-группу. Боковые функциональные группы защищали Ser, Thr- Bzl; Lys ClZ: Туг C12Bzl; His Bom; Ser MeBzl. Конденсацию проводили карбодиимидным методом с использованием диизопропилкарбодиимида и добавлением 1-гидроксибензотриазола при присоединении Gin, Lys, Gly, His. Деблокирование аминогрупп в процессе синтеза проводили 50% трифторуксусной кислотой, а нейтрализацию 7%-ным раствором диизопропилэтиламина в диметилформамиде. Пептиды снимали со смолы и деблокировали жидким фтористым водородом с добавлением n-крезола. Деблокированные пептиды очищали с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии в градиенте 0,4% трифторацетат/вода-ацетонитрил. Полипептиды характеризовали аналитической ВЭЖХ, аминокислотным анализом и FАB-масс-спектрометрией. Лиофильно высушенный стерильный препарат содержал 99,99% синтетического полипептида. Перед применением пептиды растворяли в стерильной деионизованной воде и дозировали по сухому весу.

Изучали влияние заявляемого пептида и стандарта ГМ-КСФ на кластеро- и колониеобразование у больных в фазе обострения и ремиссии агонического дерматита (площадь поражения более 70%) через 14 суток культивирования.

Результаты представлены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, использование заявляемого пептида позволяет определить не только наличие депрессии кроветворения, но и оценить выраженность ремиссии и объективными лабораторными тестами подтвердить улучшение состояния гранулоцитарно-макрофагального звена кроветворения у больных.

Пример 2. Синтез предлагаемого пептида по формуле LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS CLN HIS CYS PRO осуществляли, как oписано в примере 1. Перед применением пептид растворяли в стерильной деионизованной воде и дозировали по сухому весу.

Клетки (в количестве 5·10⁵кл/мл) из гепаринизированной крови донора выделяли методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографин ((ρ 1,077)) и после культивирования в течение 1 часа с пептидом в концентрации от 10 мкм до 1 мм в 1 мл помещали в диффузионные камеры, которые имплантировали внутрибрюшинно мышам линии СВА. Через 14 дней камеры удаляли, осторожно выдавливали их содержимое на стекло и подсчитывали кластеры, малые и большие колонии моноцитов, гранулоцитов и смешанных колоний, окрашивая их по Романовскому-Гимзе.

Результаты исследования представлены в таблице 2.

Как видно из таблицы 2, во всех концентрациях пептид оказывал выраженное влияние на кластеро- и колониеобразование. Контроль спонтанное колониеобразование в отсутствие колониестимулирующих факторов.

Пример 3. Полипептид синтезировали, как описано в примере 2. Лейкоциты выделяли из крови способом, описанным в примере 1, и помешали в планшеты с лунками 0,5см² х 1cм ² с агарозным гелем и пептидом в концентрации от 100 нм до 1 мм в 1 мл. В контроле в лунки помещали 0,86%-ный раствор NaCl. Учет проводили через 14 дней культивирования (см. таблицу 3).

Как видно из таблицы 3, предлагаемый пептид оказывал выраженное стимулирующее действие на кластеро- и колониеобразование лейкоцитов крови "in vitro".

Пример 4. Полипептид синтезировали, как описано в примере 2. Лейкоциты доноров и больных (с предполагаемой депрессией кроветворения) выделяли известным способом. Культивирование клеток осуществляли, как описано в примере 2. В качестве стимулятора использовали ГМ-КСФ и предлагаемый пептид в концентрациях 1 нм 100 нм в 1 мл. Учет проводили через 7 дней культивирования.

Результаты исследования представлены в таблице 4.

Из представленных в таблице 4 данных видно, что пептид действовал на колониеобразование практически аналогично действию полной молекулы ГМ-КСФ. Следует отметить, что у доноров ГМ-КСФ стимулировал колониеобразование больше, чем пептид. В то же время у больного пептид оказывал действие, эквивалентное влиянию ГМ-КСФ. Это свидетельствует о большей селективности действия предлагаемого пептида по сравнению с цельной молекулой ГМ-КСФ.

Пример 5. Полипептид синтезировали, как описано в примере 2. Исследовали действие предлагаемого пептида на колониеобразование донора и больного с атоническим дерматозом площадь поражения около 70% в фазе обострения, с выраженной лейкопенией (что позволило заподозрить депрессию кроветворения). Пептид использовали в концентрации 100 нм/мл. Исследование проводили по схеме, описанной в примере 3. В качестве дополнительного воздействий применяли плаз- му больного и донора для обнаружения факторов стимуляции (супрессии) в плазме крови больного.

Результаты представлены в таблице 5.

Полученные данные свидетельствуют о том, что у больного по сравнению с донором имеет место выраженная депрессия колониеобразования, усиливающаяся при добавлении к клеткам плазмы больного. Напротив кластерообразование страдало больше при добавлении гетероплазмы донора. На основании этих данных можно сделать вывод, что применение заявляемого пептида позволяет определить депрессию гранулоцитарно-макрофагального ростка кроветворения. Одновременно с пептидом можно использовать в системе тестирования другие факторы воздействия, например плазму крови, что расширяет сферу применения предлагаемого пептида как для экспериментальных целей, так и для поиска других факторов, влияющих на миелопоэз.

Пример 6. Полипептиды синтезировали, как описано в примере 2. Изучали влияние заявляемого пептида и стандарта ГМ-КСФ на кластеро- и колониеобразование у больных в фазе обострения и ремиссии атопического дерматита (площадь поражения более 70%) через 14 суток культивирования.

Результаты представлены в таблице 6.

Как видно из представленных в таблице 6 данных, синтетический полипептид с молекулярным весом 1500 дальтон действует на кластеро-и колониеобразующие клетки донора и больного аналогично влиянию более низкомолекулярного пептида 1100 дальтон. Таким образом, предлагаемые пептиды можно использовать для оценки и прогноза эффективности проводимой терапии, следовательно, расширить область применения предлагаемого объекта по сравнению с ГМ-КСФ.

Пример 7. Синтезировали, как описано в примере 1, группу полипептидов от минимального THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO- до максимального, дополнительно содержащего аминокислотные остатки из группы лизин- глицин-пролин- лейцин в последовательности от одного до четырех, вплоть до полипептида по формуле LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS CLN HIS CYS PRO. Далее методом иммуноферментного анализа изучали взаимодействие полученных полипептидов с антителами к наиболее активному из заявляемых полипептидов приблизительно 1500 дальтон.

Полученные результаты представлены в таблице 7.

Как видно из данных таблицы 7, все представленные пептиды взаимодействуют с антисывороткой к полипептиду приблизительно 1500 дальтон, а также с полным белком ГМ-КСФ (лейкомакс), что подтверждает наличие у них одинаковых антигенных детерминантов. Следовательно, можно сделать вывод, что любой из искусственных пептидов, соответствующих структуре натурального белка с последовательностью, аналогичной пептиду 1500 дальтон, и не менее пептида 1100 дальтон будет обладать в той или иной степени биологическими эффектами естественного белка.

Таким образом, заявляемое изобретение позволяет получать синтетические препараты, по структуре подобные природному ГМ-КСФ с подтвержденными свойствами полного натурального белка, что представляет несомненный интерес для биологии и медицины. В частности, все указанные полипептиды применимы для культивирования предшественников гранулоцитов и макрофагов, являющихся основой экспериментальной и клинической гематологии. ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3 ТТТ4 ТТТ5 ТТТ6 ТТТ7 ТТТ8 ТТТ9

Формула изобретения

1. Синтетический полипептид, включающий аминокислотные остатки в определенной последовательности, соответствующей фрагменту природного белка, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности действия, чистоты вещества, исключения побочных эффектов он содержит последовательно соединенные треонин-норлейцин-норлейцин-аланин-серин- гистидин-тирозин-лизин-глицин-гистидин-цистеин-пролин по формуле THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO.

2. Полипептид по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно содержит аминокислoтные остатки из группы лизинглицин-пролин-лейцин в последовательнoсти от однoго до четырех вплоть до полипептида по формуле LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYR LYS GLN HIS CYS PRO, причем полипептидная цепь содержит не менее одиннадцати аминокислотных остатков, начиная с любого из данной последовательности.

3. Способ получения синтетического полипептида, отличающийся тем, что применяют твердофазный метод с последовательным наращиванием цепи и добавлением N-метилморфолина в конденсирующую смесь, для временной защиты аминогруппы применяют Вос-группу, конденсацию проводят карбодиимидным методом, аминогруппы в процессе синтеза деблокируют 50%-ной трифторуксусной кислотой, а нейтрализуют 7% -ным раствором диизопропилэтиламина в диметилформамиде; снятие пептидов со смолы и деблокирование проводят жидким фтористым водородом с добавлением п-крезола, очистку деблокированных пептидов проводят обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией в градиенте 0,4% трифторуксусная кислота/вода-ацетонитрил.

4. Средство для культивирования предшественников гранулоцитов и макрофагов, молекула которого соответствует фрагменту природного белка, отличающееся тем, что состоит из последовательно соединенных остатков аминокислот из группы лиз-глицин-пролин-лейцин-треонин-норлейцин-норлейцин-аланин-серин-гистидин-тирозин-лизин-глицин-гистидин-цистеин-пролин по формуле LYS GLY PRO LEY THR NLE NLE ALA SER HIS TYP LYS GLN HIS CYS PRO причем полипептидная цепь содержит не менее одиннадцати аминокислотных остатков, начиная с любогo из данной последовательности.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10