Способ биологического контроля адаптогенов

 

Использование: медицина, способ определения биологической активности препаратов адаптогенов. Сущность изобретения: в качестве тест-культуры используют один из штаммов Saccharomyces cerevisiae, который выращивают на специальной питательной среде, обеспечивающей сниженную скорость роста дрожжевых клеток, далее определяют количественный прирост этих клеток в присутствии адаптогена и без него, качество культуры клеток и, учитывая вид адаптогена, определяют биологическую активность исследуемого препарата по предложенной формуле. 3 ил. 15 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к способам определения биологической активности препаратов адаптогенов.

Известные способы биологического контроля препаратов адаптогенов, выращенных in vitro, заключаются в изучении влияния препарата на показатели физической выносливости экспериментальных животные. Общую физическую выносливость исследуют на модели "плавания" животных с грузом и "бега" на тредбане с последующей оценкой ориентировочной и исследовательской активности (Александрова И. В. Данилина А.Н. Кудрин А.В. и др. "Изучение нового лекарственного препарата из культуры тканей женьшеня. Сообщение I." Фармацея, 1962, N4; Кудрин А.В. Александрова И.В. Крендаль Ф.П. "Адаптогенная активность настойки биомассы культуры тканей женьшеня. Сообщение 2." Фармацея, 1982, N5; Кудрин А.В. Крендаль Ф.П. Александрова И.В. "Изучение безопасности применения препаратов из биомассы культуры тканей женьшеня в эксперименте. Сообщение 2. " Фармацея, 1982, N6; Крендаль Ф.П. "Исследование препарата из культуры тканей радиолы розовой." Фармацея, 1989, N5, с.58-62).

Однако из-за необходимости содержания лабораторные животных, эти способы практически неприменимы на производстве, трудоемки и поэтому экономически нецелесообразны.

Известны также способы производственного химического контроля препаратов адаптогенов, заключающиеся в определении суммарной гликозидной фракции (СГФ) для препарата биоженьшень (Временная фармакопейная статья. Настойка "Биоженьшень". ВФС-42-1890-89) и массовой доли фенольных соединений в пересчете на солидрозид (ФС) для препарата биородиола (ТУ-64-13-06-87. Настой биомассы радиолы розовой), используемые в условиях поточного производства. Такие методы намного проще хроматографического анализа, недоступного для контроля больших партий препаратов. Однако они также не позволяют обнаружить фальсификацию малоактивного препарата, например, при добавлении глюкозы в настойку биоженьшеня, а в случае биородиолы дают заниженные цифры из-за методического экранирования части фенольных соединений.

Известен также способ определения биологической неэквивалентности химически идентичных лекарственных веществ, обладающих биостимулирующими свойствами (А. С. N 1623426, МКИ G OI N 33/15), заключающийся в воздействии биостимулятора в минимально действующих "концентрациях на Paramеcium condatum, где исследуемый и стандартный биостимулятор вносят в солевой раствор, делают посев парамеций и по различию особей в образцах судят об их биологической неэквивалентности.

Недостатком этого способа является невозможность количественной оценки биологической активности малоактивного препарата, а также неприемлемость этого способа в производственных условиях из-за трудоемкости.

Целью предлагаемого способа является повышение объективности способа посредством обеспечения количественных характеристик необходимых величин, а такие упрощение способа настолько, чтобы его применение стало возможным в промышленных условиях.

Указанная цель достигается тем, что в качестве тест-культуры используют один из штаммов Saccharomyces cerevisie который выращивают на специальной питательной среде, уменьшающей скорость роста дрожжевых клеток, далее определяют количественный прирост этих клеток в присутствии адаптогена и без него, качество культуры клеток и, учитывая вид адаптогена, определяют биологическую активность исследуемого препарата.

Фиг. 1. Индекс пролиферации культуры клеток Saccharomyces cerevisiae после 4-х часов культивирования в зависимости от активности препарата биоженьшень, выраженной в единицах СГФ.

Фиг. 2. Индекс пролиферации культуры клеток Saccharomycas carevisiae после 4-х часов культивирования в зависимости от активности препарата биородиола, выраженной в единицах ФС.

Фиг. 3. Индекс пролиферации культуры клеток Saccharomycas carevisiaе после 4-х часов культивирования в зависимости от количества гликозы, добавленной в среду культивирования на фоне постоянной дозы этанола.

Способ осуществляют следующим образом. В качестве тест-культуры используют штамм пекарских дрожжей как один из простейших эукариот, методически удобный и неприхотливый в работе. Данный штамм выращивают в специальной питательной среде, которая снижает скорость роста дрожжевых клеток в такой степени, чтобы время анализа не превышало длительности рабочего дня. Определяя количественный прирост этих клеток в присутствии препарата и без него, качество культуры клеток и используя параболическую зависимость, параметры которой специфичны для вида адаптогена, биологическую активность адаптогена рассчитывают по следующей формуле: где i_p- индекс пролиферации (отношение концентрации клеток в некоторый момент времени к посевной, в нашем случае на 4-й час культивирования), k коэффициент, равный для биоженьшеня 0.33, а для биородиолы 0.24, v объем препарата в среде культивирования в μ₁, К_кк коэффициент качества культуры, определяемый по формуле: где i_p(+K) и i_{p (-K)} индексы пролиферации на среде с глюкозой и на специальной среде, соответственное определяемые на 4-й час роста.

Формула (1), аппроксимирующая зависимость активности адаптогенов от индекса пролиферации, выведена по результатам измерений на стандартные образцах адаптогенов (фиг. 1, 2).

Для каждого препарата существует свой диапазон стандартных значений активности: препарат биоженьшеня с активностью меньше 0.12% а для биородиолы меньше 0.05% не соответствует стандарту, при значениях активности выше этих величин препараты пригодны для применения.

Пример выполнения способа. Штамм пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae в течение суток выращивают на полной среде с агаром. Далее культуру пересевают на жидкую среду, состоящую из водного раствора, пептона, дрожжевого экстракта и этанола. Суспензию клеток разливают по 50 мл в колбы объемом 250 мл.

В каждую колбу добавляют разное количество препарата адаптогена. Положительным контролем (+K) служит полная жидкая среда, содержащая глюкозу. Отрицательным контролем (-K) является среда, снижающая скорость деления клеток.

Культивирование проводят на качалке при ЗО^oС и 260 об/мин в течение 4 часов. Концентрацию клеток в каждой колбе можно определять спектрофотометрически. Общую биологическую активность определяют по формуле (1).

Изобретение поясняется табл. 1 15.

Пример 1. Опредн- ление биологической активности препарата биоженьшень. Препарат N 1, 40%-ная настойка (СГФ=0.12%).

Среднее значение А_g0.12±0.02 (по двум опытам). Можно сделать вывод, что оно в пре- делах ошибки эксперимента не отличается от величины СГФ0.12% полу- ченной химическим анализом.

Среднее значение A_g=0.27±0.03 (по трем опытам). Можно сделать вывод, что оно в пределах ошибки эксперимента не отличается от величины СГФ=0.25% полученной химическим анализом.

Пример 2. Выделение фальсификации оценки активности адаптогена при добавлении глюкозы.

Для выявления фальсифицированных путем добавления глюкозы настоек авторы экспериментально определили зависимость индекса пролиферации используемой культуры клеток от количества глюкозы, добавленной в среду культивирования в присутствии постоянного количества этанола (2%). Соответствующий график в отличие от обратной параболы в случае дозовой зависимости индекса пролиферации для разных адаптогенов (1) (фиг.1, 2) имел вид кривой с насыщением (фиг. 3), которую можно описать формулой: где С концентрация адаптогена.

На фиг.3 видно, что добавление глюкозы в культуральную среду свыше 0.012 г/мл, не приводит к увеличению индекса пролиферации культуры клеток, значение индекса пролиферации выходит на плато. Эти результаты легли в основу для выявления фальсифицированных с помощью глюкозы малоактивных настоек.

Из приведенных примеров видно, что увеличение индекса пролиферации прекращается, начиная с дозы настойки 1.2 мл и, следовательно, дозовая зависимость i_p1 не может быть описана формулой (1). Характер нарастания i_p аналогичен кривой на фиг. 3. Несмотря на то, что химический анализ препаратов 3 и 4 показал высокое содержание СГФ 0.23, предлагаемый способ биологического контроля не подтвердил эти результаты и выявил явное присутствие глюкозы в препаратах.

Пример 3. Определение биологической активности препарата биородиола. Препарат N 2, 20%-я настойка (ФС=0.212%).(ФС=0.24%).

Среднее значение А_r= 0.21%±0.ОЗ (по пяти опытам), можно сделать вывод, что оно в пределах ошибки эксперимента не отличается от величины ФС0.24% полученной химическим анализом.

Препарат N 2, 40%-я настойка (ФС=0.17%).

Среднее значение А_r= 0.19%±0.02 (по трем опытам). Можно сделать вывод, что оно в пределах ошибка эксперимента не отличается от величины ФС=0.17% полученной химическим анализом.

Таким образом, данный способ повышает объективность оценки качества препарата адаптогена по количественным характеристикам общей биологической активности, а также позволяет отличить малоактивные, фальсифицированные с помощью глюкозы препараты биоженьшеня. Способ прост в выполнении, не требует сложной и дорогостоящей аппаратуры, поэтому его можно эффективно использовать в производственных лабораториях. 2 ТТТ1 ТТТ2 ТТТ3 ТТТ4 ТТТ5 ТТТ6 ТТТ7

Формула изобретения

Способ биологического контроля адаптогенов, включающий посев тест-культуры в питательную среду, внесение исследуемого препарата с последующим определением прироста биомассы тест-объекта в присутствии адаптогена по сравнению с контролем, отличающийся тем, что в качестве тест-культуры используют дрожжи вида Saccharomyces cerevisial и посев проводят в питательную среду, обеспечивающую сниженную скорость роста дрожжевых клеток.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12