Металлокомплексы порфирин-кетонов, чувствительный элемент для оптического определения кислорода в жидкой или газовой среде и способ определения кислорода

 

Использование: в аналитической химии, ветеринарии, медицине, биотехнологии и пищевой промышленности при оптическом определении кислорода. Сущность изобретения: платиновые и палладиевые комплексы новых замещенных порфирин-кетонов. Чувствительный элемент для оптического определения кислорода в жидкой или газовой среде в виде сформованного из полистирола изделия с распределенными в нем платиновыми или палладиевыми комплексами новых замещенных порфирин-кетонов в качестве фосфоресцирующего красителя. Чувствительный элемент выполнен в виде пленки толщиной 1-20 мк. Пленка может быть закреплена на твердой подложке или оптическом элементе. Сформованное изделие может содержать слой кислород-зависимого фермента. Способ определения кислорода посредством такого чувствительного элемента, находящегося в контакте с анализируемым образцом и связанного посредством оптического волокна с детектором фосфоресценции с оптимальной чувствительностью 700-850 нм. Фосфоресценцию чувствительного элемента возбуждают светодиодом в области поглощения красителя и регистрируют ее в импульсном режиме с временным разрешением с переменным временем задержки при возбуждении светодиодом с оптимальной величиной эмиссии в диапазоне 570-630 нм. Концентрацию кислорода рассчитывают по величине интенсивности и/или времени жизни фосфоресценции исходя из одноэкспоненциального характера затухания фосфоресценции. Платиновые и палладиевые комплексы новых замещенных порфирин-кетонов имеют квантовые выходы и времена жизни фосфоресценции, близкие к порфириновым комплексам, и интенсивную полосу поглощения в области 560-620 нм. Величина сдвига видимой полосы поглощения составляет 50-60 нм по сравнению с металлопорфирином. Фосфоресценция смещается в длинноволновую область примерно на 100 нм. Это позволяет упростить процесс оптического определения кислорода в жидкой или газовой среде и повысить точность определения.10 ил.

Изобретение относится к области аналитической химии и техники и может быть использовано в медицинской диагностике, клинической медицине, в биотехнологии, пищевой промышленности, ветеринарии, экологических исследованиях.

В тех случаях, когда стоит задача определения или непрерывного мониторинга биологически активных соединений, наиболее эффективным является использование устройств-биосенсоров.

Молекулярный кислород является одним из важнейших объектов анализа и в то же время субстратом множества ферментативных реакций. Он, как известно, является также эффективным тушителем люминесценции красителей. Эффективность тушения люминесценции кислородом определяется длительностью (или временем жизни) люминесценции, природой красителя и среды, в которой регистрируется тушение. При удачном подборе люминесцирующего красителя, матрицы для него и соответствующих элементов оптоэлектроники возможно создание эффективных оптических кислородных сенсоров, способных осуществлять точное количественное определение кислорода. Соответствующий прибор может быть реализован с использованием компактного, простого и дешевого (волоконно) оптического оборудования [1] Оптическая детекция кислорода может вестись путем измерения интенсивности люминесценции либо времени жизни люминесценции красителя. Последний подход является более предпочтительный, поскольку он не зависит от концентрации красителя, ее изменении во времени и флуктуаций рабочих характеристик компонентов оптической детектирующей системы [2] В настоящее время в литературе описан ряд подходов к созданию оптических кислородных сенсоров и ферментных биосенсоров на их основе. В качестве активного кислород-чувствительного элемента в них обычно используются полимерные композиции на основе люминесцирующих красителей, которые проницаемы для молекулярного кислорода, растворенного в анализируемой системе. Он выполняется в виде кислородной мембраны, которая наносится или крепится на конце оптического волокна или в рабочей оптической ячейке.

В качестве люминесцирующих кислород-чувствительных элементов предложено использовать полимерные композиции на основе полиароматических красителей (например, пирена или декациклена [3]), а также на основе флуоресцирующих комплексов рутения (Ru(bpy)3, Ru(phen)3 и др.) [4] Однако полиароматические красители требуют ультрафиолетового возбуждения, что сложно реализуется на волоконно-оптическом оборудовании и светодиодах. Кроме того, короткая длительность люминесценции этих красителей усложняет создание сенсоров основанных на принципе измерения времен жизни. Это связано с быстродействием полупроводниковой электроники (свето- и фотодиодов), которая также обычно составляет порядка 1-2 микросекунд. Комплексы рутения, как правило, обладают сложной координационной химией и фотохимией и плохо растворимы в полимерах, обычно используемых для получения кислород-чувствительных композиций. Это приводит к практическим сложностям при создании простых, компактных и дешевых приборов.

Наиболее близким к изобретению являются фосфоресцирующие красители, чувствительные элементы на их основе и способ определения кислорода, описанные в патенте [5] Его основу составляет использование фосфоресцирующих красителей порфириновой природы Pt- и Pd-комплексов порфиринов. Эти красители имеют полосы поглощения в видимой области спектра и обладают интенсивной фосфоресценцией [6] Показана их эффективность для люминесцентной детекции кислорода.

Однако при создании кислородных сенсоров и биосенсоров на основе этих соединений возникают следующие проблемы. Во-первых, платиновые комплексы порфиринов, которые наиболее удобны для детекции кислорода в физиологическом диапазоне концентраций О-20% в воздухе или 10-250 мМ в воде), плохо совместимы с имеющейся полупроводниковой оптоэлектроникой, главным образом с источниками света. Зеленые и темно-зеленые светодиоды (на основе GaP, с узким спектром испускания и максимумом при 557 и 567 нм, соответственно) оказываются малоэффективными для возбуждения люминесценции Pt-порфиринов (они имеют узкую полосу поглощения с максимумом при 535 нм). В то же время синие светодиоды (на основе SiC с широким спектром испускания и максимумом в области 480 нм) имеют существенно более низкий энергетический выход по сравнению с светодиодами видимого спектра [7] К тому же интеграл перекрывания их эмиссии и поглощения Pt-порфиринов невелик.

Палладиевые комплексы порфиринов имеют более удобные спектральные характеристики и могут возбуждаться зелеными светодиодами. Однако в обычных условиях (насыщение воздухом) их люминесценция в сотни раз потушена кислородом из-за чересчур большого времени жизни, которое составляет порядка 1 миллисекунды. Это делает их малопригодными для измерения кислорода в физиологическом диапазоне концентраций.

При использовании полимерных люминесцирующих композиций на основе металлопорфиринов для оптической детекции кислорода также возникает ряд сложностей. К ним относится, в частности, то, что кинетика люминесценции описанных в патенте [5] полимерных композиций на основе металлопорфиринов (полихлорвинил, полиметилметакрилат с пластификаторами в качестве матриц) имеет многоэкспоненциальный характер. Это существенно затрудняет калибровку, обработку экспериментальных данных и определение концентрации кислорода по люминесценции и может влиять на точность измерений. Невысокая фотохимическая стабильность порфириновых соединений также ограничивает их применение в оптических сенсорах.

В настоящее время не описано создание и использование оптоволоконных устройств для детекции кислорода на базе полупроводниковой электроники и фосфоресцирующих порфириновых красителей, а также ферментных биосенсоров.

Задачей настоящего изобретения является синтез новых, фосфоресцирующих красителей, являющихся производными металлокомплексов порфиринов, главным образом Pt(II)- и Pd(II)-комплексов, которые перспективны, в частности, для использования в волоконно-оптических кислородных сенсорах.

Другой целью изобретения является разработка чувствительных элементов на основе этих новых красителей, главным образом полимерных кислород-чувствительных фосфоресцирующих композиций (кислородных мембран и/или покрытий), а также ферментных мембран на основе вышеуказанных кислород-чувствительных композиций и кислород-зависимых ферментов. Названные чувствительные элементы предназначены для оптической детекции кислорода и/или биологически активных соединений (метаболитов) в образцах.

Наконец, целью изобретения является разработка нового способа определения кислорода, который основан на использовании вышеописанных фосфоресцирующих красителей и чувствительных элементов.

Сущность изобретения и реализации поставленных целей заключаются в следующем.

Синтез новых фосфоресцирующих красителей осуществляют путем направленной химической модификации порфиринового макроцикла, которая проводится таким образом, чтобы, затронув в минимальной степени способность соответствующих металлокомплексов, интенсивно фосфоресцировать при комнатной температуре, изменить при этом спектральные характеристики фосфоресценции. Производные порфиринов получаются селективным окислением определенного фрагмента порфиринового макроцикла, которое приводит к изменению вследствие этого электронных спектров и некоторых физических характеристик. Процесс химической модификации заключается в конечном счете в получении новых соединений - порфирин-кетонов (или оксо-хлоринов), из которых затем получают металлокомплексы с Pt²⁺ и Pd²⁺. В результате такой модификации удалось синтезировать ранее не описанный класс соединений, которые отличаются структурой, оптическими и физическими свойствами от соответствующих порфириновых соединений, а также родственным им комплексам хлоринов, дигидрохлоринов и т.п. [8]).

Структура комплексов порфирин-кетонов (I), а также родственных им комплексов порфиринов (II) и хлоринов (III) приведена ниже.

Схема синтеза металлокомплексов порфирин кетонов приведена ниже.

Pt- и Pd-комплексы порфирин-кетонов также интенсивно фосфоресцируют при комнатной температуре, квантовые выходы и времена жизни фосфоресценции близки к соответствующим порфириновым комплексам. Они имеют интенсивную полосу поглощения (возбуждения) в области 580-620 нм, которая на 50-60 нм более длинноволновая по сравнению с соответствующими металлопорфиринами. Спектр фосфоресценции также смещен в длинноволновую область более чем на 100 нм. В частности, Pt-комплексы порфирин-кетонов имеют длинноволновый максимум поглощения 591 нм и максимум фосфоресценции при 758 нм. Благодаря таким свойствами они хорошо совместимы с полупроводниковыми источниками видимого света (например, желтыми светодиодами имеющими оптимум эмиссии при 586 нм) и могут быть эффективно использованы для детекции кислорода вместо соответствующих Pt-порфиринов. Полосы поглощения и фосфоресценции палладиевых комплексов порфирин-кетонов сдвинуты соответственно на 10 и 30 нм в красную область по сравнению с платиновыми комплексами и также эффективно возбуждаются желтыми или оранжевыми и красными светодиодами.

Новые соединения, формально будучи частично окисленными производными порфиринов, помимо более удачных спектральных характеристик, выгодно отличаются от известных еще повышенной устойчивостью к фото- и химическому окислению. Соответствующие экспериментальные данные приведены в дополнительных материалах.

Как отмечалось выше, длинноволновый сдвиг электронных спектров полученных соединений достигается путем снижения ароматичности макроциклической структуры металлокомплекса. Аналогичный эффект известен также и для флуоресцирующих хлоринов, бактериохлоринов и их металлокомплексов (M.Gouterman. The Porphyrins/ed. D.Dolphin, 1979, v. 3, pp.1-165). Однако эти структуры, которые формально можно рассматривать как восстановленные порфирины, сильно подвержены фотоокислению и малоперспективны для применения в аналогичных целях. Высокой нестабильностью к фото- и химическому окислению обладают также порфирин-диоды и их металлокомплексы промежуточные соединения синтеза порфирин-кетонов (см.схему синтеза).

Металлокомплексы различных порфирин-кетонов, полученных из соответствующих порфиринов и различающиеся только боковыми заместителями порфиринового ядра в 1-8 положениях, имеют близкие люминесцентные свойства. Все они с незначительными модификациями методик могут использоваться согласно настоящему изобретению.

На основе вышеописанных металлокомплексов-порфирин-кетонов, главным образом гидрофобных произвольных, а также полистирола, разработаны люминесцирующие кислород-чувствительные композиции (пленки). Новые композиции имеют ряд преимуществ по сравнению с ранее описанными композициями Pd- и Pt-порфиринов. В частности, их люминесценция описывается одноэкспоненциальным законом затухания, что существенно упрощает процедуру измерений и обработку экспериментальных данных при регистрации кислорода по принципу измерения времени жизни люминесценции. Они имеют быстрые и обратимые отклики на изменение концентрации кислорода. Эти полимерные композиции предназначены для использования в волоконно-оптических кислородных сенсорах и ферментных биосенсорах на их основе в качестве кислород-чувствительных элементов (мембран или покрытий). Композиции могут содержать небольшие добавки пластификаторов для улучшения их механических и адгезионных свойств. Мембраны и/или покрытия на основе вышеописанных композиций позволяют точно и количественно определять содержание кислорода на основании измерения интенсивности и/или времени жизни люминесценции.

Ферментные мембраны получают путем сопряжения соответствующих кислород-зависимых ферментов (или ферментных систем) с вышеописанными кислородными мембранами. Например, для фермента глюкозооксидазы (ГО), который катализирует реакцию: количественную оценку содержания субстрата можно вести опосредованно по уровню потребления кислорода.

Ферментные мембраны готовят путем иммобилизации фермента или ферментной системы, одним из субстратов которой является кислород, непосредственно на вышеописанной кислород-чувствительной полимерной композиции [1,2] Полученные таким образом мембраны чувствительны к соответствующему второму субстрату фермента. При введении субстрата в насыщенный воздухом анализируемый раствор такая мембрана дает люминесцентный отклик (возгорание люминесценции вследствие снятия тушения кислородом), который пропорционален концентрации субстрата. Мембраны с иммобилизованными глюкозооксидазой, лактатоксидазой, этинолоксидазой, холестериноксидазой, уреказой и т.п. могут использоваться в качестве активных элементов в соответствующих устройствах (биосенсорах) вместо вышеописанных кислородных мембран для определения соответственно глюкозы, лактата, этанола, холестерина, мочевой кислоты и др.

Новый способ определения кислорода основан на использовании вышеописанных чувствительных элементов, содержащих новые кислород-чувствительные фосфоресцирующие красители, а также полупроводниковой оптоэлектроники и электронных схем микросекундной временной логики, которые позволяют вести измерение интенсивности и/или времени жизни люминесценции вышеуказанных композиций.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Синтез Pt-октаэтилпорфин-кетона (гидрофобный, водонерастворимый краситель).

а) 100 мг октаэтилпорфина (ОЭП) растворяют в 30 мл хлороформа. Добавляют 200 мг OsO₄ и 3 капли пиридина. Выдерживают 24 часа в темноте и затем пропускают через раствор ток сероводорода в течение 10 мин. Осадок сульфида осмия отфильтровывают. Раствор упаривают в вакууме досуха. Остаток хроматографируют на колонке с силикагелем в системе хлороформ/эфир 95/5, Собирают основную фракцию цис-диола октаэтилпорфина, упаривают, кристаллизуют из хлороформ/метанола. Выход около 40% б) 40 мг цис-диола октаэтилпорфина растворяют в 10 мл концентрированной серной кислоты и выдерживают 10 минут при комнатной температуре. Затем смесь выливают на тонкоизмельченный лед, нейтрализуют водным аммиаком. Осадок отфильтровывают, сушат, растворяют в 5 мл хлороформа и хроматографируют на колонке с силикагелем в хлороформе. Собирают основную фракцию октаэтилпорфин-кетона. Кристаллизуют из хлороформ/метанола. Выход около 90% в) 30 мг октаэтилпорфин-кетона растворяют в 3 мл бензонитрила, добавляют 200 мг K₂PtCl₄ и кипятят в течение 3 часов. Затем смесь упаривают досуха. Остаток кипятят с 50 мл хлороформа 15 минут, полученный раствор упаривают досуха. Остаток хроматографируют на колонке с силикагелем в системе хлороформ/ацетон 95/5. Собирают основную фракцию платинового комплекса октаэтилпорфин-кетон (Pt-ОЭП-кетон). Упаривают, получают 18 мг основного вещества. Выход около 60% Данные элементного анализа для Pt-октаэтилпорфин-кетона. Найдено, C - 57,99; H 5,90; N 7,50. C₃₆H₄₄N₄OPt. Вычислено, C - 58,07; H 5,96; N 7,53.

Пример 2. Получение Pd-октаэтилпорфин-кетона. 30 мг октаэтилкетона (см. пример 1) растворяют в 10 мл диметилформамида, добавляют раствор 100 мг PdCl₂ в 10 мл диметилформамида. Нагревают при 110^oС в течение 30 минут. Охлаждают до 70-80^oС, добавляют по каплям 5 мл воды, охлаждают. Выпавший осадок фильтруют, кристаллизуют из хлороформ/метанола. Получают 27 мг палладиевого комплекса октаэтилпорфин-кетона. Выход около 90% Данные элементного анализа для Pd октаэтилпорфин-кетон. Найдено, С - 65,89; H 6,69; N 8,50. C₃₆H_44>N₄OPd. Вычислено, C - 65,99; H 6,77; N 8,55.

Пример 3. Синтез Pt-копропорфирин I-кетона (водорастворимый краситель) и его тетраэтилового эфира.

а) 100 мг тетраэтилового эфира копропорфирина I обрабатывают аналогично примеру 1а), но выдерживают с OsO₄ 12 часов. Получают цис-диол тетраэтилового эфира копропорфирина I с выходом 30% б) 30 мг цис-диола растворяют в 10 мл концентрированной серной кислоты при 0^oC при перемешивании, выдерживают 15 минут. Раствор выливают на 100 г льда, нейтрализуют аммиаком. Осадок фильтруют, сушат, хроматографируют. Выход около 75% тетраэтилового эфира копропорфирина I-кетона (ТЭЭ КП-кетон).

в) 20 мг ТЭЭ КП-кетона растворяют в 5 мл бензонитрила, добавляют 150 мг K₂PtCl₆ и кипятят 1 час. Раствор упаривают досуха. Остаток экстрагируют хлороформом. Хроматографируют на колонке с силикагелем в системе хлороформ/эфир 10/1. Выход платинового комплекса тетраэтилового эфира копропорфирин I-кетона 75%
Данные элементного анализа для Pd копропорфирин I-кетона ТЭЭ. Найдено, C 59,51; H 5,87; N 6,27. C₄₄H₅₂N₄Pd. Вычислено, C - 59,56; H 5,91; N 6,31.

г) 15 мг тетраэтилового эфира Pd-копропорфирин I-кетона растворяют в 10 мл диоксана, добавляют 100 мг КОН в 1 мл воды. Нагревают при 70^oC в течение 4 часов. Добавляют 50 мл воды, нейтрализуют до рН 5 соляной кислотой. Осадок отфильтровывают, сушат. Выход Pt-копропорфирин I-кетона около 100%
Данные элементного анализа для Pd копропорфирин I-кетона. Найдено, C - 55,71; H 4,63; N 7,20. C₃₆H₃₆N₄O₉Pd. Вычислено, C 55,78; H 4,68; N 7,23.

Пример 4. Синтезы других комплексов порфирин-кетонов.

Pd комплексы копpопорфирин I-кетона и его тетраэтилового эфира синтезируются исходя из ТЭЭ копропорфирин I-кетона и PdCl₂ идентично комплексам октаэтилпорфин-кетону (см.пример 2).

Комплексы этиопорфирин-кетона (R₁= R₃= R₅= R₇=CH₃, R₂=R₄=R₆=R₈=CH₂CH₃) синтезируются полностью аналогично соответствующим комплексам октаэтилпорфина (см. примеры 1, 2 описания).

Синтез Pd и Pt комплексов копропорфирина III-кетона и их тетраэтиловых эфиров. Копропоpфирин III (R₁= R₃= R₅= R₈= CH₃, R₂=R₄R₆R₇ CH₂CH₂COOCH₂CH₃ окисляют OsO₄ с последующей инкубацией с серной кислотой и очисткой аналогично примеру 1. При этом ввиду ассиметричной структуры исходного порфирина получается смесь четырех основных изомеров копропорфирин-кетона, которые спектрально неразличимы (т.е. идентичны) используется для получения Pt и Pd комплексов, методика полностью аналогична описанным в примерах 2, 3.

Пример 5. Люминесцентные свойства металлокомплексов порфирин-кетонов. Корректированные спектры возбуждения и некорректированные спектры эмиссии (фосфоресценции) снимали на люминесцентном спектрометре LS-50 (Perkin Elmer, Англия) для разбавленных растворов красителей (0,1-1,0 мМ) в соответствующем растворителе (толуол или водный буфер). Спектры Pt-октаэтилпорфина и синтезированного Pt-октаэтилпорфин-кетона приведены на рис.1. Спектры аналогичных Pd-производных приведены на рис.2. Как видно, химическая модификация приводит к значительному длинноволновому смешению в спектрах возбуждения и эмиссии новых красителей.

Спектры возбуждения и эмиссии металлокомплексов различных производных порфирин-кетонов (например Pt-ОЭП-кетон, Pt-капропорфирина I-кетона и тетраэтилового эфира Pt-копропорфирина I-кетона) практически идентичны вышеописанным (рис.1, 2).

Сравнительные свойства комплексов порфирин-кетонов приведены в таблице.

Времена жизни фосфоресценции Pt-октаэтилпорфин-кетона и Pd-октаэтилпорфинкетона в обескислороженных растворах (мицеллярный 1% раствор Тритона Х-100, содержащий 10 мг/мл сульфита натрия, рН 7,0) при комнатной температуре составляют 60 и 450 микросекунд соответственно (25^oС). Для соответствующих металлопорфиринов эти значения составляют порядка 95 и 1100 микросекунд. Для производных различной структуры временные характеристики также оказываются близкими.

Пример 6. Получение и свойства полимерных композиций на основе Рt-порфирин-кетонов.

10 мг Pt-ОЭП-кетона растворяют в 1 мл хлороформа. Полученный раствор смешивают с 10 мл 5% раствора полистирола в толуоле. Полученный раствор полимерной композиции хранят при комнатной температуре в темноте.

Для получения кислород-чувствительных покрытий и мембран раствор полимерной композиции наносят тонким слоем на горизонтальную поверхность оптического элемента (стеклянная пластина, прозрачная полиэфирная пленка или торец оптического волокна) и высушивают на воздухе в течение 1-12 часов. Полученные таким образом элементы с нанесенной пленкой полимерной композиции толщиной 1-20 микрон имеют удовлетворительные механические свойства и могут использоваться для оптической детекции кислорода в водной и газовой фазах. Высокая концентрация красителя в пленке обеспечивает эффективное поглощение возбуждающего света (оптическая плотность на длине волны 595 нм составляет 0,1-2 единиц) и высокие уровни люминесцентного сигнала.

На рис.3 показаны кинетики затухания люминесценции полимерных композиций Pt- и Pd-октаэтилпорфин-кетонов в полистироле и их линеаризация по одноэкспоненциальному закону. Характер зависимостей не изменяется при различных концентрациях кислорода и при изменении концентрации красителя в полимере в диапазоне 0,1-50 мМ последнего. Времена жизни люминесценции красителей в композиции в отсутствии тушителя (кислорода) составляют 63,0 мкс и 450 мкс для Pt- и Pd-комплекса соответственно, при 25^oC.

На рис. 4 приведена калибровочная кривая для определения кислорода (давления воздуха) в газовой фазе с использованием полимерной кислород-чувствительной композиции на основе Pt-октаэтилпорфин-кетона. Она представлена в шкале времен жизни фосфоресценции (микросекунды), а также в линеаризованном виде в координатах Штерна-Фольмера (t_o/t [Q]). Амплитуда изменения времени жизни для обескислороженных и насыщенных воздухом сред составляет около 4 раз при 25^oС. Изменения интенсивности люминесценции и их характер аналогичны изменениям времени жизни люминесценции, что свидетельствует об истинно динамическом типе тушения люминесценции красителей в полимерных композициях.

Аналогичным образом получают полимерные композиции исходя из Pt-, Pd-комплексов тетраэтилового эфира копропорфирина I-кетона и других гидрофобных порфирин-кетонов. Люминесцентные и кислород-чувствительные свойства полученных композиций аналогичны вышеописанным.

Содержание люминесцирующего красителя в полимерной композиции диктуется практическими соображениями. Нижний предел обусловлен чувствительностью детектирующей системы, поскольку величина фосфоресцентного сигнала прямо связан с концентрацией красителя. Верхний предел обусловлен, с одной стороны, растворимостью красителя в полимере, а с другой эффективностью поглощения возбуждающего света данной композицией. Если эффективность поглощения близка к 100% то практически весь возбуждающий свет трансформируется в фосфоресценцию и дальнейшее увеличение концентрации красителя не имеет смысла. В частности, для системы Pt-октаэтилпорфин-кетон-полистирол в описании указан исследованный диапазон концентраций красителя 0,1-50 мМ, который и соответствует весовому диапазону, приведенному затем в формуле: верхний предел составляет 5% (в/в). При более высоком соотношении при испарении растворителя (толуола) краситель в полимерной пленке агрегирует и/или выпадает в осадок, и удельный фосфоресцентный сигнал не растет. При 5% весовом содержании красителя эффективность поглощения возбуждающего света 3-микронной пленкой композиции составляет около 50% что близко к теоретическому пределу и вполне удовлетворяет практическим задачам.

Сравнение фотостабильности комплексов порфиринов и порфирин-кетонов проводили следующим образом. По одинаковым методам (см.выше) были изготовлены кислород-чувствительные элементы на основе pt-ОЭП и Pt-ОЭП-кетона, которые затем были подвергнуты интенсивному облучению полихроматическим светом в одинаковых условиях. Через 18-часов остаточный люминесцентный сигнал (интенсивность) составлял соответственно 34% и 95% т.е. фотохимическая стабильность кислород-чувствительных мембран на основе Pt-ОЭП-кетона примерно в 10 раз лучше, чем для аналогичных на основе Pt-ОЭП. Эти свойства также делают использование новых соединений более предпочтительным по сравнению с известными.

Пример 7. Определение кислорода с использованием полимерных композиций на основе платиновых комплексов порфирин-кетонов.

Для этого был сконструирован прототип волоконно-оптического кислородного сенсора, изображенный в общем виде на рис.5. Основной его компонент - погружной активный элемент, который представляет собой кислород-чувствительную мембрану на основе вышеописанных полимерных композиций, закрепленную на конце раздвоенного волоконно-оптического жгута. Жгут обеспечивает эффективную оптическую связь между кислородной мембраной и оптоэлектронным детектором.

Люминесцентный детектор оптимизирован под измерении люминесценции вышеописанных композиций. В нем используется импульсный режим измерения длительной люминесценции, который основан на согласованной модуляции интенсивности источника света (светодиода) и фотоприемника (фотодиода). Такой режим позволяет определять световые сигналы через определенное время (время задержки) после короткой вспышки источника света. Время задержки может быть переменной величиной, ее величина сравнима с временем затухания люминесценции композиции. Это позволяет определить по нескольким точкам кинетику затухания свечения, а также опорный сигнал (т.е. когда время задержки существенно превосходит время затухания), и рассчитать, таким образом, время жизни специфического сигнала (люминесценции).

Блок-схема оптического кислородного сенсора, в состав которого входит оптоэлектронный люминесцентный детектор и кислородная мембрана на основе Pt-октаэтилпорфин-кетона, приведена на рис.6. В него входят:
люминесцирующая мембрана на основе Pt-комплекса порфирин-кетона;
(волоконно)оптический узел (раздвоенный световой жгут);
полупроводниковой импульсный источник света (светодиод или лазер) с оптимумом эмиссии в области 550-650 нм;
фотоприемник (фотодиод) с оптимумом чувствительности в области 700-850 нм;
электрическая схема модуляции интенсивности источника света;
электрическая схема модуляции напряжения на фотоприемнике;
электрическая схема согласования двух схем модуляции, обеспечивающая их обратную связь и переменное время задержки;
блок предусиления и/или усиления электрического сигнала с фотодиода;
блок обработки сигнала и вывода сигнала (аналоговый и/или цифровой);
блок питания постоянного тока.

Устройство функционирует следующим образом.

Кислородная мембрана (диск диаметром 8 мм, закрепленный на общем конце раздвоенного волоконно-оптического жгута) имеет диффузионный контакт с анализируемым объектом (жидкость или газ), а также (волоконно)оптическую связь с детектором люминесценции. Оптический канал: светодиод мембрана фотодиод также оснащен оптическими фильтрами для эффективной дискриминации возбуждающего света и фосфоресценции. Светодиод обеспечивает возбуждение люминесценции композиции в области поглощения красителя, фотодиод - регистрацию фосфоресценции, испускаемой красителем, в соответствующей спектральной области. Электрический сигнал с фотодиода проходит схему предусиления и усиления и при необходимости преобразуется из аналогового в цифровой. Схемы модуляции, работающие в согласованном режиме с основной частотой порядка 1 кГц, необходимы для измерения рабочего и опорного сигналов. Рабочий сигнал с фотодиода измеряется спустя определенное время после затухания светодиода (время задержки), которое сравнимо с длительностью люминесценции красителя: диапазон 10-100 микросекунд. При работе в режиме измерения времен жизни рабочий сигнал измеряется при нескольких значениях времени задержки. Опорный сигнал измеряется при времени задержки значительно больше длительности люминесценции: порядка 300-1000 микросекунд. Время интегрирования единичного сигнала (ворота счета) сравнимо с временем затухания красителя и составляет порядка 100 микросекунд. Время накопления сигнала эквивалентно времени 100-1000 вспышек источника света. Принципиальная схема измерения времени жизни люминесценции приведена на рис.7. Схемы обработки и вывода информации с учетом величины опорного сигнала рассчитывают интегральные специфические сигналы (в единицах интенсивности люминесценции или времен жизни) и соответствующие им содержание кислорода в анализируемой среде. Устройство предусматривает проведение начальной калибровки по кислороду по крайней мере по двум точкам и периодических подкалибровок.

Вышеописанное устройство позволяет измерять интенсивность и/или время жизни люминесценции вышеописанных кислородных мембран или покрытий, помещенных на конец раздвоенного оптического волокна, и по результатам этих измерений рассчитывать содержание кислорода в анализируемом образце.

На рис.8 показана типичная кривая люминесцентного отклика пленки на изменение концентрации кислорода в системе (водный раствор). Время 95% отклика составляет порядка 10 сек, включая время переноса активного элемента из раствора насыщенного воздухом в обескислороженный раствор.

Пример 8. Получение чувствительных элементов с использованием ферментов-оксидаз.

а) Чувствительный элемент для определения глюкозы.

Полимерную композицию получают и наносят на полиэфирную подложку аналогично примеру 3. На полученной таким образом кислородной мембране иммобилизуют фермент глюкозоксидазу. Это осуществляют следующим образом. 50 мг фермента растворяют в 1 мл дистиллированной воды и добавляют раствор глутарового альдегида до конечной концентрации 0,2% (в/в). Полученный раствор наносят на горизонтальную поверхность кислородной мембраны, равномерно распределяя его по площади примерно равной 25 см² и высушивают досуха на воздухе (1-3 часа). Полученную таким образом глюкозооксидазную мембрану хранят при +4^oC в сухом виде или в фосфатном буфере, рН 7,0 с 0,1% азида натрия.

Для детекции глюкозы используют вышеописанный кислородный датчик (см. пример 6), активный элемент которого оснащен вышеописанной глюкозооксидазной мембраной, а не кислородной мембраной. Измерения проводят в 0,05 М фосфатном буфере. Волоконно-оптический активный элемент последовательно погружают в растворы с различным содержанием глюкозы (в промежутках промывают чистым буфером) и контролируют изменением интенсивности люминесценции. Характерный вид кривой люминесцентного отклика волоконно-оптического глюкозного биосенсора погружного типа показан на рис.9. Величина конечного отклика в образце глюкозы (стационарный сигнал) после стабилизации люминесцентного сигнала (характерное время 2-10 мин) служит для количественной оценки содержания анализируемого вещества. По величине этого отклика (интенсивности или времени жизни) определяют соответствующее ему содержания глюкозы в образце, используя предварительно полученную калибровку.

б) Чувствительный элемент для определения холестерина.

Ферментную мембрану на основе кислород-чувствительной композиции pt-ОЭП-кетон-полистирол и холестериноксидазы (из Pseudomonas fluorescens) получали аналогично методике из примера 7. К 0,2 мл фермента (3 мг/мл, 100 Ед/мл) добавляли глутаровый альдегид в конечной концентрации 0,2% наносили на поверхность кислородной мембраны (площадь 10 см²) и инкубировали 1 час при комнатной температуре (не высушивать досуха). Затем мембрану промывали и хранили в буфере при 4^oС.

На рис. 10 показан отклик ферментной мембраны на холестерин, 3 мг/мл. Условия: 0,05 М К-фосфатный буфер, рН 7,0, 10 мг/мл холата натрия, 23^oC. Методика измерений аналогична примеру 7.

Таким образом, в патенте описан новый класс фосфоресцирующих красителей, имеющих длинноволновые спектральные характеристики и высокую фотохимическую стабильность, которые перспективны для ряда практических применений. В частности, чувствительные элементы, разработанные на их основе, а также способ определения кислорода позволяют осуществлять точную количественную детекцию кислорода и спектра важнейших метаболитов с использованием несложной реагентной, методической и инструментальной базы.

Подписи к рисункам
Рис. 1. Спектры возбуждения (А) и спектры эмиссии (Б) Pt-октаэтилпорфина (_{____}) и Pt-октаэтилпорфин-кетона Условия: 1 мкМ раствор красителя в обескислороженном мицеллярном водном растворе (1% Тритон Х-100, 10 мг/мл сульфита натрия, рН 7), 25^oС.

Рис. 2. Спектры возбуждения (А) и спектры эмиссии (Б) Pd-октаэтилпорфина (_{____}) и Pd-октаэтилпорфин-кетона Условия: 1 мкМ раствор красителя в обескислороженном мицеллярном водном растворе (1% Тритон Х-100, 10 мг/мл сульфита натрия, рН 7), 25^oС.

Рис. 3. Кинетики затухания фосфоресценции композиций Pt-октаэтилпорфинкетона (А) и Pd-октаэтилпорфин-кетона (Б) и полистирола и их линеаризация по одноэкспоненциальному закону затухания. Условия: 25^oС, соотношение полимер/краситель 100/1.

Рис.4. Калибровочная кривая для определения кислорода (давления воздуха) в газовой фазе с использованием композиции Pt-октаэтилпорфин-кетон - полистирол. Кривая 1 в координатах (t_q, P), кривая 2 линеаризация в координатах Штерна-Фольмера (t_o/t, P). Условия аналогичны рис.3.

Рис 5. Принцип работы волоконно-оптического кислородного (био)сенсора.

Рис. 6. Блок-схема оптоэлектронного люминесцентного детектора кислородного сенсора. 1 волоконно-оптический выход с детектора на мембрану; 2 - светодиод; 3 фотодиод; 4 схема модуляции светодиода; 5 схема модуляции фотодиода; 6 схема синхронизации и задачи времени задержки; 7 - предусилитель и/или усилитель; 8 процессор для обработки и вывода информации.

Рис. 7. Схема модуляции напряжения на источнике света и фотоприемнике, используемая в оптоэлектронном детекторе для измерения интенсивности и/или времени жизни люминесценции полимерных композиций.

Рис.8. Стабильность интегрального люминесцентного сигнала (интенсивности, А), и кривая отклика волоконно-оптического кислородного сенсора на изменение концентрации кислорода в анализируемом водном растворе (Б). Изменение интенсивности (и соответственно времени жизни люминесценции) на кривой Б в области 40 сек отражает процесс переноса активного элемента из насыщенного воздухом раствора в обескислороженную среду.

Рис. 9. Отклик погружного волоконно-оптического глюкозного биосенсора мембранного типа на различные концентрации глюкозы.

Рис. 10. Отклик погружной ферментной мембраны на основе кислород-чувствительной полимерной композиции и холестериноксидазы на наличие холестерина (3 мг/мл) в анализируемом образце.

Формула изобретения

1. Металлокомплексы порфирин-кетонов общей формулы

где R₁-R₈ водород, низший алкил или -CH₂-CH₂COOR₉;
R₉ водород или алкил;
М Pt²⁺ или Pd²⁺,
в качестве фосфоресцирующих красителей.

2. Металлокомплексы порфирин-кетонов по п.1, отличающиеся тем, что заместители R₁-R₈ означают этил.

3. Металлокомплексы порфирин-кетонов по п.1, отличающиеся тем, что заместители R₁, R₃, R₅ и R₇ означают метил, а R₂, R₄, R₆ и R₈ означают СН₂СН₂СООН.

4. Металлокомплексы порфирин-кетонов по п.1, отличающиеся тем, что заместители R₁, R₃, R₅ и R₇ означают метил, а R₂, R₄, R₆ и R₈ означают СН₂СН₂СООСН₃.

5. Чувствительный элемент для оптического определения кислорода в жидкой или газовой среде, представляющий собой сформованное изделие из кислородопроницаемого полимера с распределенным в нем фосфореcцирующим красителем, отличающийся тем, что он выполнен в виде изделия, сформованного из полистирола, содержащего в качестве красителя металлкомплексы порфирин-кетонов общей формулы

где R₁-R₈ -водород, низший алкил или -СН₂СН₂СООR₉;
R₉ водород или алкил;
М Pt²⁺ или Pd²⁺.

6. Элемент по п.5, отличающийся тем, что он содержит в качестве красителя металлкомплексы октаэтилпорфирин-кетонов в количестве 5% от массы полистирола.

7. Элемент по пп.5 и 6, отличающийся тем, что он выполнен в виде пленки толщиной 1-20 мк.

8. Элемент по пп.5 и 7, отличающийся тем, что он выполнен в виде пленки, закрепленной на твердой подложке или оптическом элементе.

9. Элемент по пп.5 и 8, отличающийся тем, что сформованное изделие дополнительно содержит слой кислородзависимого фермента.

10. Способ определения кислорода, включающий использование чувствительного элемента на основе проницаемого для кислорода полимера с распределенным в нем фосфоресцирующим красителем, находящегося в контакте с анализируемым образцом и связанного посредством оптического волокна с детектором фосфоресценции, возбуждение фосфоресценции чувствительного элемента светодиодом в области поглощения красителя, регистрацию фосфоресценции и расчет концентрации кислорода по величине интенсивности и/или времени жизни фосфоресценции, отличающийся тем, что в качестве полимера используют полистирол, в качестве фосфоресцирующего красителя металлокомплексы общей формулы

где R₁-R₈ относятся к радикалам из группы водород, низший алкил или СН₂-СН₂-COO-R₉;
R₉ водород или алкил;
М Pt²⁺, Pd²⁺,
регистрацию флуоресценции ведут в импульсном режиме с временным разрешением с переменным временем задержки при возбуждении светодиодом, характеризующимся оптимальной величиной эмиссии в диапазоне 570 630 нм, при этом используют детектор с оптимальной чувствительностью при 700 850 нм, а расчет времени жизни ведут исходя из одноэкспоненциального характера затухания фосфоресценции.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что в качестве фосфоресцирующего красителя используют Pt-октаэтилпорфин-кетон, характеризующийся оптимальным значением фосфоресценции при длинах волн возбуждения и фосфоресценции 591 и 790 нм соответственно, а возбуждение осуществляют желтым светодиодом CaAs, характеризующимся оптимальной величиной эмиссии при 586 нм.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12