Способ получения токсина микромицета alterharia solani

 

Использование: биотехнология, выделение токсина микромицета Alternaria solani. Сущность изобретения: выделяют несколько изолятов агрессивной расы микромицетов, культивируют их раздельно на картофельно-глюкозном агаре в течение 20 суток. Выращенные культуры заливают стерильной дистиллированной водой, выдерживают в течение десяти суток, затем отделяют жидкие токсичные фракции, выпаривают при 95^oC до получения сухого токсина темно-бурого цвета и объединяют. 2 табл.

Предлагаемое изобретение относится к биотехнологии и касается выделения токсина патогенного гриба, который может использоваться в приготовлении селективных сред для оценки, отбора и отбраковки сомаклональных клеточных линий и семенных гибридных популяций при селекции картофеля на болезнеустойчивость.

Альтернариоз /синонимы макроспориоз, ранняя сухая пятнистость листьев / широко распространенное в мире заболевание картофеля, по вредности не уступающее другой хозяйственно-значимой грибной листовой пятнистости - фитофторозу, ежегодно проявляется на картофельных плантациях в ранние сроки. Вызывается грибом Alternaria solani в отечественной литературе встречается под названием Macrosporium solani. Патогенные свойства паразита в значительной степени связаны с продуцированием альтернариевой кислоты, обладающей сильным фитотоксическим действием и способной диффундировать внутрь живых тканей картофеля и убивать их. /Анненков Б. Г. Макроспориоз картофеля в Хабаровском крае. Научно-технич. бюлл. ДальНИИСХ. Иммунитет и защита картофеля и овощей от болезней и вредителей на Дальнем Востоке. Новосибирск, 1990, вып. 2, с. 9-14.

Иванюк В. Г. Токсичность альтернариевой кислоты продуцента возбудителей ранней сухой пятнистости картофеля. Научн. трубы НИИКХа, M. 1974, вып. 20, с. 125-130/. Таким образом, токсин, выделяемый из гриба, вызывает у растений те же симптомы, что и живой возбудитель.

В настоящее время значительно изучен токсин возбудителя кольцевой бактериальной гнили картофеля /С. Sepedonicum/. /Stronel G. A. phytotoxins. - Ann. Rev. Biochem, 1982, 51:309-333.

Иванова Н. Г. Разработка селективного фактора для проведения клеточной селекции на устойчивость к Сorynebacterium sepedonicum. Научн. труды НИИКХа /Использование клеточных технологий в селекции картофеля. М. 1987, с. 26-32. /. Он выделен, идентифицирован, предварительно очищен и используется на направленного отбора сомаклональных линий-регенерантов при клеточной селекции картофеля на устойчивость к этому бактериозу. /Бутенко Р. Г. Хромова Л. М. Седнина Г. В. Методические указания по получению вариантных клеточных линий и растений у разных сортов картофеля. М. ВАСХНИЛ, 1984, 28 с. Рассадина Г. В. Хромова Л. М. Бутенко Р. Г. Эффективность клеточной селекции на устойчивость к кольцевой гнили картофеля. Научн. труды НИИКХа /Использование клеточных технологий в селекции картофеля. М. 1987, с. 32-46./.

Аналогов получения токсина гриба Alternaria solani не имеется.

Целью предлагаемого изобретения является ускоренное получение высушенного технического токсического препарата гриба Alternaria solani.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве продуцентов токсина берут изоляты агрессивной расы из разных регионов для получения усредненного продукта, мицелий гриба инкубируют на застывшей питательной среде /КГА/ при 28^oC в темном термостате, полученную двадцатидневную культуру гриба заливают стерильной дистиллированной водой в объеме 25 мл на одну чашку Петри и через 10 дней после заливки культуральную жидкость выпаривают при 95^oС на водяных банях, а полученный сухой остаток темно-бурого цвета считают металлическим шпателем и объединяют.

Неочищенный препарат, содержащий токсин и другие продукты жизнедеятельности гриба, предпочтителен для селективного использования, поскольку его действие на растительные клетки более тождественно влиянию живого патогена. Во время культуральных работ с возбудителем альтернариоза картофеля обнаружено, что агрессивные патотипы гриба /раса М-40-классификация БелНИИКПО/ при очень быстром росте на общеизвестном картофельно-глюкозном агаре /КГА/ продуцирует с диффузией в поверхностный слой среды фитотоксичный продукт красно-бурого цвета /альтернариевую кислоту/, поэтому процесс наработки токсина можно контролировать глазомерно.

При культивировании гриба на питательных средах по Мурасиге и Скугу, используемых в клеточной селекции, наблюдается умеренный рост, но теряется агрессивность, и токсин не образуется.

Пример выполнения способа. Расплавленную и простерилизованную КГА разливали на одну треть высоты стандартных стерильных чашек Петри в микробиологическом боксе. Сразу после застывания среды садили в центр чашки крупный кусочек мицелия и инкубировали при 28^oC в темном термостате. Гриб покрывал всю поверхность среды КГА в чашках на 10-й день. В качестве продуцентов токсина брали три изолята агрессивной расы /типа ВКМ Г-3048 из Всесоюзной коллекции микроорганизмов из трех регионов: из Белоруссии, Приморья и Приамурья и высаживали параллельно в одинаковое количество чашек Петри для получения усредненного продукта, поскольку изоляты могут отличаться интенсивностью роста и токсинообразования и проявлять некоторую сортоспецифичность. Заливка десятидневной культуры гриба стерильной дистиллированной водой /для вытяжки токсина/ в количестве 25 мл может приводить к разбраживанию субстрата в связи с еще недостаточной концентрацией в нем токсина. Более предпочтительным вариантом является заливка 20-дневных культур гриба стерильной дистиллированной водой в объеме 25 мл на одну чашку Петри /табл. 1/, без соблюдения особых условий стерильности при заливке, поскольку данный токсин обладает широким бактерицидным и фунгитоксическим действием. Соблюдение температурных параметров при культивации гриба и обязательная заливка дистиллированной /или дождевой, снеговой/ водой соответствует биологическим потребностям патогена. Использование для вытяжки ацетона и других суперрастворителей /спирт, гексан и др./ не рационально, поскольку этот растворитель убивает гриб и вытягивает только наработанный к моменту заливки в верхней части среды токсин. Быстро высыхая, он делает процесс диффузии токсина из субстрата и мицелия в жидкость неэффективным.

Максимальный выход технического токсина /свыше 100 мг с одной чашки Петри/ получали при инкубировании залитой /стерильной дистиллированной водой/ 20-дневной культуры гриба при температуре 28^oC через 10 дней после заливки.

Более длительная инкубация залитых культур не рациональна в связи с высыханием жидкости. Для выделения токсина культуральную жидкость сливали в фарфоровые глазированные плошки и выпаривали при 95^oC на водяных банях. Сухой остаток темно-бурого /почти черного/ цвета счищали металлическим шпателем и объединяли. Остаток содержит наряду с токсином и продуктами жизнедеятельности гриба минеральные и органические остатки, взятые из КГА.

В специальном эксперименте /табл. 2/ проверяли патогенность гриба технического токсина. Для этого в короткие пробирки, заполненные стерильной жидкой питательной средой на основе макроэлементов по Мурасиге и Скугу, но с добавками токсина в различных концентрациях /повторность вариантов 10-кратная/, ставили срезанные у основания пробирочные оздоровленные растения /высотой 6-8 см/ двух сортов: Приекульского раннего /не устойчивого к альтернариозу/ и Невского /устойчивого/ и определяли токсичность концентраций продукта по периоду потери тургора у растений.

Полученный продукт обладал ярко выраженными токсическими для растений картофеля свойствами, заключающимися в дифференцированной по времени /сортовой и видовой/ способности лизировать клеточные оболочки и растительные мембраны и отравлять ткани.

Способ получения токсина гриба Alternaria solani дает возможность ускоренно и в достаточных количествах получать высушенный технический /не очищенный/ токсический препарат гриба Alternari asolani в любой лаборатории, ведущей исследования в области клеточно-тканевых культур "in vitro" для использования его в селективных средах при сомаклональной клеточной селекции картофеля на болезнеустойчивость, без наличия специального биохимического оборудования для очистки.

Формула изобретения

Способ получения токсина микромицета Alterharia solani, заключающийся в том, что выделяют несколько изолятов агрессивной расы микромицетов, культивируют их раздельно на картофельно-глюкозном агаре в течение двадцати суток, выращенные культуры заливают стерильной дистиллированной водой, выдерживают в течение десяти суток, затем отделяют жидкие токсичные фракции, выпаривают при 95°С до получения сухого токсина темно-бурого цвета и объединяют.

РИСУНКИ

Рисунок 1