Штамм актиномицета agromyces cerinus subsp. cerinus - продуцент тивелозы

 

Использование: микробиологическая промышленность, научно-исследователькая практика, получение биохимических реактивов. Сущность изобретения: штаммы Agromyces cerinus subsp.cerinus ВКМ Ас-1358Д выделен путем высева из водной суспензии почвы на разбавленную агаризованную среду МПБ. Хорошо растет на различных средах, в том числе синтетических, в условиях аэрации при 26 - 30^oС и pH 6,0 - 8,0. Положительный эффект: синтезирует тивелозу в количестве до 4,5 мг/г сухих клеток или 26 мг/г сухого препарата клеточных стенок. Штамм не патогенен и не токсичен для теплокровных животных.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности и научно-исследовательской практике.

Тивелоза (3,6-дидезокси-Д-арабиногексоза) является моносахаридом, входящим в состав О-антигенов грамотрицательных бактерий [1] Тивелоза может быть использована в качестве реактива в научно-исследовательской практике, связанной с микробиологией, иммунологией, медициной, а также в биоорганической химии при исследовании полисахаридов и липополисахаридов [2-4] Не обнаружено сведений о получении тивелозы химическим синтезом, к тому же структура этого моносахарида свидетельствует о сложности возможного синтеза этого соединения по аналогии с другими 3-дезоксигексозами [2] Известны штаммы грамотрицательных бактерий Jersinia pseudotuberculosis, Salmonella typhi и S.strasbourg, осуществляющие синтез тивелозы [1 и 5] Описано выделение тивелозы из биомассы штаммов S.typhi, выращенных на питательных средах, содержащих, г/л: рыбный фарш 500; пептон 10; NaCl 3; Na₂HPO₄ 2 [5] Сведения о количественном содержании тивелозы в клетках данных штаммов не приводятся, однако, исходя из содержания и химической структуры липополисахарида, включающего тивелозу [4] можно считать, что данные штаммы синтезируют низкое количество тивелозы. Кроме того, патогенность и вирулентность этих штаммов ограничивают возможность использования их для получения тивелозы, особенно, в производственных условиях.

Задача изобретения заключается в усовершенствовании микробиологических способов получения тивелозы.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, состоит в получении сапрофитного непатогенного штамма микроорганизмов с повышенной способностью к синтезу тивелозы.

Штамм Agromyces cerinus subsp. cerinus выделен из почвы Московской области путем высева из водной суспензии почвы (разведение 1:1000) на разбавленную в 10 раз агаризованную среду МПБ, с последующей инкубацией в течение 7 суток при 28^оС.

Штамм Agromyces cerinus subsp. cerinus депонирован и хранится во Всесоюзной коллекции микроорганизмов при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР под номером ВКМ Ас-1358Д.

Штамм Agromyces cerinus subsp. cerinus ВКМ Ас-1358Д характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культуральные признаки.

а) На агаризованной среде ПДС (28^оС, 2 сут) колонии восково-желтые, выпуклые, с ровным краем, врастающие в агар. Диаметр 2-4 мм. Поверхность колоний гладкая, консистенция пастообразная или слизистая. Воздушный мицелий не образуется.

б) На глюкозо-аспарагиновом агаре (глюкоза 10 г, аспарагин 1 г, К₂НРО₄ 1г, агар 20 г, вода 1 л, рН 6,8-7,0) (28^оС, 2 сут) колонии лимонно-желтые, плоские, вросшие в агар. Вокруг колоний формируется ореол из радиально ориентированных субстратных гиф. Воздушный мицелий не образуется.

в) При выращивании на жидких органических средах (ПДС, МПБ) (28^оС, 2-3 сут. ) без встряхивания наблюдают помутнение последних. На поверхности сред образуется слабая пленка, а также кольцо из адсорбированных к внутренней поверхности пробирки клеток. На дне пробирки накапливается осадок из осевших клеток.

Морфологические признаки. Тонкие (0,2-0,4 мкм) ветвящиеся гифы, распадающиеся на дифтероидные и палочковидные, неправильной формы, неподвижные фрагменты. Эндо- и экзоспоры не образуются. Грамположителен.

Физиолого-биохимические признаки.

Строгий аэроб.

Температурный оптимум роста 26-28^оС, штамм не растет при 37^оС.

Хорошо растет в интервале рН 6,0-8,0.

Некислотоустойчив, Каталазо- и оксидазоположителен. Имеет окислительный тип метаболизма. Использует широкий спектр сахаров в качестве единственного источника углерода: L- и D-арабинозу, глюкозу, галактозу, ксилозу, сахарозу, маннозу, мальтозу, мелецитозу, рамнозу, раффинозу, трегалозу, инозит. Утилизирует сукцинат, цитрат, фумарат. Гидролизует крахмал, арбутин и эскулин. Обладает нитратредуктазной активностью, утилизирует минеральные и органические источники азота. Растет на синтетических средах. Не требователен к витаминам и другим факторам роста.

Хемотаксономические признаки. В клеточной стенке содержится 2,4-диаминомасляная кислота, галактоза, рамноза, тивелоза. Преобладающие менахиноны ненасыщенные, с 12-тизвенной изопреноидной цепочкой. В спектре жирных кислот преобладают насыщенные изо- и антеизоразветвленные кислоты. Содержание Г+Ц пар 70 мол.

Штаммы рода Agromyces не патогенны и не токсичны для теплокровных животных.

Штамм Agromyces cerinus subsp. cerinus ВКМ Ас-1358Д хранят в пробирках на агаризованной пептонно-дрожжевой среде (ПДС) состава, г/л: глюкоза 5,0; пептон 5,0; дрожжевой экстракт 3,0; К₂НРО₄ 0,2; агар-агар 15,0; рН 7,2-7,4 под вазелиновым маслом, а также в лиофилизированном состоянии (протектор обезжиренное молоко) при 4^оС.

Штамм A. cerinus subsp. cerinus ВКМ Ас-1358Д синтезирует тивелозу при выращивании на различных средах, в том числе синтетических. Содержание тивелозы в биомассе до 4,5 мг/г сухих клеток, в препаратах клеточных стенок 26 мг/г высушенного препарата.

Содержание тивелозы в биомассе определяют относительно концентрации сахара в стандартном растворе после гидролиза биомассы или клеточных стенок в 1н трифторуксусной кислоте методом газожидкостной хроматографии.

Тивелоза может быть выделена путем кислотного гидролиза биомассы или нативных клеточных стенок с последующей очисткой продукта методами колоночной и/или тонкослойной хроматографии (ТСХ) на силикагеле [7] П р и м е р 1. Свежепересеянную культуру штамма Agromyces cerinus subsp. cerinus ВКМ Ас-1358 Д смывают с косяка питательной средой и засевают в колбы емкостью 500 мл, содержащие 200 мл питательной среды следующего состава, г/л: глюкоза 5,0; пептон 5,0; дрожжевой экстракт 3,0; К₂НРО₄ 0,2; рН среды 7,2-7,4. Выращивают на качалках при 30^оС в течение 24-28 ч. К концу культивирования содержание тивелозы в биомассе составляет 7 мг/г сухих клеток.

Для получения препарата тивелозы клетки осаждают центрифугированием в течение 15 мин при 5000 об/мин, отмывают ацетоном и высушивают в токе воздуха. Биомассу (5 г) гидролизуют в 1н трифторуксусной кислоте при 100^оС в течение 1,5 ч. После отделения осадка центрифугированием супернатант упаривают в вакууме досуха. Образовавшийся темно-коричневый остаток (около 2 г) растворяют в 5 мл воды и прибавляют 60 мл этанола. Выпавший осадок отделяют центрифугированием, а супернатант упаривают досуха в вакууме. Сухой остаток (1 г) хроматографируют на колонке с силикагелем марки L 40/100 в системе растворителей хлороформ-метанол-вода 75:25:1. Контроль за разделением осуществляют с помощью ТСХ на силикагелевых пластинках в этой же системе растворителей. Фракции, содержащие чистый моносахарид, объединяют и упаривают. Получают 22 мг белого порошка, содержащего 16 мг тивелозы.

П р и м е р 2. Штамм выращивают как описано в примере 1, но используют синтетическую среду состава, г/л: глюкоза 5; NaNO₃ 1; К₂НРО₄ 0,5; MgSO₄ 0,5; вода водопроводная. Получают биомассу с содержанием тивелозы 4 мг/г сухих клеток.

П р и м е р 3. Штамм выращивают как описано в примере 1. Содержание тивелозы в биомассе составляет 4,5 мг/г сухих клеток. Суспензию клеток обрабатывают ультразвуком (22 кГц, 3 мин). Центрифугированием (4 тыс. об/мин, 10 мин) отделяют неразрушенные клетки и из супернатанта осаждают клеточные стенки (12 тыс. об/мин, 20 мин). Клеточные стенки отмывают несколько раз водой и ацетоном и подсушивают в токе воздуха. Получают препарат клеточных стенок, содержащий 26 мг тивелозы/г препарата.

Таким образом, предлагаемый штамм актиномицетов Agromyces cerinus subsp. cerinus ВКМ Ас-1358Д синтезирует тивелозу до 4,5 мг/г сухих клеток. Кроме того, он не токсичен и не патогенен, что позволяет широко использовать его в промышленности и в научно-исследовательской практике.

Формула изобретения

Штамм актиномицета Agromyces cerinus subsp. cerinus BKM Ac - 1358 D - продуцент тивелозы.