Способ идентификации грибов рода candida в жидком биологическом субстрате

 

Использование: в области медицины, в частности к микробиологии. Сущность изобретения: жидкий биологический субстрат инкубируют в среде, оптимальной для роста микроорганизмов, с добавлением полианитол-сульфоната натрия, затем центрифугируют, осаждают протеины, высушивают под вакуумом, проводят силилирование с использованием реагента N-триметилсилилимидазола, полученные силильные производные экстрагируют гексаном с последующим хроматографическим анализом. Способ позволяет повысить чувствительность и надежность идентификации грибов рода Candida.

Изобретение относится к области медицины, а именно к хроматографическим методам исследования при диагностике грибковых инфекций.

Известны микробиологические способы диагностики грибковых инфекций, в том числе вызываемых грибами рода Candida на фоне сопутствующей микрофлоры [1, 2] Однако эти способы трудоемки и длительны, так как включают в себя ряд взаимосвязанных операций, так, например, необходимо из биологического субстрата выделить чистую культуру и затем ее идентифицировать, что занимает даже на дорогостоящем импортном оборудовании (система "Авантаж", АПИ-20АИХ) значительное время.

В настоящее время при решении задач идентификации, таксономии и классификации бактерий успешно используются методы газожидкостной хроматографии.

Наиболее близким аналогом к предлагаемому техническому решению является диагностика грибковых инфекций методом газожидкостной хроматографии по метаболистическому профилю сыворотки крови, и в частности путем определения содержания таких маркерных соединений, как пятиатомный сахарный спирт - арабинитол и манноза [3] Способ заключается в том, что, подвергая отобранную кровь центрифугированию, получают сыворотку крови пациента. Из полученной сыворотки отделяют протеины путем осаждения их ацетоном. Центрифугат (надосадочную жидкость) высушивают под вакуумом и проводят процедуру силилирования. Затем аликвоту (2 мкл) полученного раствора вводят в хроматограф, оценивая уровень арабинитола и маннозы. Идентификацию соединений на хроматограмме проводят, сравнивая время удерживания соединений пробы с временем удерживания триметилсилильных производных хроматографических стандартов.

Однако выделение и анализ специфического компонента продукта жизнедеятельности грибов рода Candida в сыворотке крови является довольно сложной задачей, так как количество арабинитола в сыворотке крови чрезвычайно мало и определение его идет на пределе чувствительности хроматографии (0,1 мкг/мл), а применение дорогостоящей массо-спектрометрической аппаратуры малооправданно. Кроме того, в данном способе наиболее вероятна контаминация пробы микроорганизмами окружающей среды. Бактерицидные свойства сыворотки также мешают проведению адекватного анализа, и невозможно определить динамику заболевания и контролировать ход лечения.

Целью предлагаемого изобретения является повышение чувствительности и надежности способа.

Поставленная цель достигается тем, что биологический субстрат перед его центрифугированием инкубируют в среде, оптимальной для роста микроорганизмов с добавлением полианитол-сульфонат натрия, в качестве силилирующего агента используют N-триметилсилилимидазол и проводят экстракцию силильных производных, например, гексаном.

Существенными признаками предлагаемого изобретения является инкубация биологического субстрата перед его ценрифугированием, это дает возможность значительно увеличить количество информативного компонента арабинитола, так как увеличивается контрация грибов в питательной среде. Полученные концентрации арабинитрола, в результате применения вышеуказанного приема, экспрессно и надежно определяются хроматографическим методом. В то время как традиционно применяемыми методами идентификация грибов на этой стадии подращивания не всегда дает положительные результаты.

Кроме того, в качестве силилирующего реагента применяют N-триметилсилилимидазол. Это позволяет при наличии влаги в образце получать достоверные результаты. Экстракция силильных производных гексаном позволяет повысить чувствительность и надежность метода путем концентрирования пробы и понижения фона реактива.

Способ осуществляется следующим образом.

Пример 1. Кровь для посева берут у больного согласно методическим указаниям по применению унифицированных бактериологических методов исследования в клинико-диагностических лабораториях 1 2 1.

Кровь в количестве 20 мл инкубируют в триптиказо-соевом бульоне с добавлением полианитол-сульфонат натрия в течение 72 часов. Культуральную жидкость центрифугируют в течение 15 мин. при 5000 об./мин. Отбирают 0,2 мл надосадочной жидкости, вводят 0,2 мл внутреннего стандарта. Раствор упаривают в вакууме досуха, добавляют 0,05 мл N-триметилсилилимидазола и 0,05 мл гексана. Аликвоту гексанового экстракта вводят в газовый хроматограф. Детектор пламенно-ионизационный. Для анализа используют кварцевые капиллярные колонки с метилсилиликоновой неподвижной фазой. Хроматографирование ведут в режиме программирования от 100^o до 200^o со скоростью 4^oС в мин.

С использованием компьютерной системы вычисляют содержание арабинитола в среде с донорской кровью и кровью пациента с грибковым сепсисом.

Превышение содержания арабинитола свыше 200 мкг/мл принимают как подозрение на грибковую септицемию.

Пример 2. Спинномозговую жидкость для посева берут согласно методическим указаниям и инкубируют в триптиказо-осевом бульоне с добавлением полианитол-сульфонат натрия в течение 72 часов. Культуральную жидкость подвергают процедурам, описанным в примере 1.

Содержание арабинитола в культуральной среде после посева спинномозговой жидкости пациента с грибковым сепсисом в 5-10 раз превышает содержание его в контрольном опыте (до 100-200 мкг/мл).

Исследование 25 новорожденных детей со вспышкой лихорадки неясной этиологии бактериологическим методом и заявляемым дало 100% сходимость получаемых результатов (таблица).

Однако в большинстве случаев результаты бактериологического анализа поступали значительно позже (через 5-10 суток) после выдачи результатов хроматографического анализа.

Данные анализа по прототипу [3] давали в ряде случаев ложные результаты из-за трудности детектирования арабинитола на пределе чувствительности хроматографа и бактерицидного действия крови, а также применения антифунгальных препаратов.

Заявляемый способ позволяет осуществлять диагностику грибковой инфекции с высокой степенью надежности вследствие высоких концентраций появляющегося арабинитола и наличия добавки полианитол-сульфанат натрия, которая уменьшает бактерицидное воздействие крови.

Копия акта испытания способа идентификации грибов рода Candida в биологических субстратах новорожденных детей прилагается.

Формула изобретения

Способ идентификации грибов рода Candida в жидком биологическом субстрате, включающий его центрифугирование, осаждение протеинов, высушивание под вакуумом и силилирование с последующим газохроматографическим анализом, отличающийся тем, что жидкий биологический субстрат перед его центрифугированием инкубируют в среде, оптимальной для роста микроорганизмов, с добавлением полианитол-сульфоната натрия, в качестве силилирующего реагента используют N-триметилсилилимидазол, а газохроматографическому анализу подвергают силильные производные.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2