Способ микробиологической очистки объектов от нефтяных загрязнений

 

Использование: предлагаемый способ относится к области микробиологической очистки различных объектов окружающей среды от нефтяных загрязнений, а также к охране биосферы. Сущность изобретения: предлагаемый способ заключается в том, что для очистки объектов от нефтяных загрязнений в зависимости от условий и степени загрязнения используют биомассу в виде суспензии, пасты или порошка природных штаммов бактерий: Acinetobacter sp. (bicoccum) B-6445 или Rhodococcus sp. S-1213, или Arthrobacter sp. S-1212, причем соотношение расхода биомассы к нефтяным загрязнениям составляет 1:10² - 10⁵.

Предлагаемый способ относится к области микробиологической очистки различных объектов окружающей среды от нефтяных загрязнений и охране биосферы.

Задачи, стоящие перед авторами, и актуальность разработанного способа состоят в том, что экологические нарушения природной среды, вызванные разливами в местах ее добычи, хранения, транспортировки, переработки и использования, приобретают все большее распространение. По данным мировой литературы (см. например, Leahy I.D. Colwell R.R. Microbiological Rewiev, 1990, v. 54, N 3, p. 305 315) только лишь за счет аварий танкеров ежегодно в моря и океаны выбрасывается до 10 млн. т нефти. В районах ее добычи из-под сельскохозяйственного использования выводятся тысячи гектаров плодородных земель, пастбищ, загрязняются рыбохозяйственные водоемы и источники питьевой воды.

В природных условиях присутствуют многочисленные и разнообразные группы микроорганизмов (бактерии, дрожжи, грибы), потребляющие углеводороды нефти. Однако самоочищающая способность этих микроорганизмов совершенно недостаточна, особенно при интенсивном загрязнении почв и водоемов. При аварийных выбросах нефти происходит гибель живых организмов, составляющих экосистему, и для восстановления ее целостности необходимо инициирование процесса деструкции углеводородов.

Ранее были предложены способы биоочистки природной среды.

Так, например, известен способ очистки почвы от нефтяных загрязнений (авт. свид. N 1428809, E 02 B 15/04, Б.И. N 37, 1988) с помощью препарата "путидойл", созданного на основе бактериальной культуры Pseudomonas putida шт. 36. Препарат вносится на загрязненную поверхность совместно с минеральным удобрением нитроаммофоской, содержащей азот в аммонийной и нитратной форме, а также фосфор и калий. Бактериальная культура используется в количестве 10⁴ кл в 1 мг/л. Недостатками препарата и способа его применения являются: 1) бактериальная культура выращивается на мелассе сырье, отличающемся от природного субстрата (нефти), для утилизации которого препарат предназначен; это обусловливает низкую эффективность препарата в природных условиях; 2) применение в качестве "подкормки" нитратных форм азота способствует дополнительному загрязнению окружающей среды токсическими нитрат-ионами; 3) культура Preudomonas putida шт. 36 обладает желатиназной и гемолитической активностью, что может препятствовать развитию процесса самоочищения с помощью ассоциаций микроорганизмов; 4) способ имеет ограничение по применению, так как предназначен только для очистки почвы; 5) не представлены данные по эффективности очистки: расход препарата рассчитан на поверхность площади земли, степень загрязнения которой может быть различной.

Наиболее близким по сущности и достигаемому техническому результату является способ очистки почвы и воды от нефтяных загрязнений (патент N 2014286, кл. C 02 F 3/34, E 02 B 15/04, 1994), который основан на применении комбинаций микроорганизмов (бактерий и дрожжей: Acinetobacter oleovorum, Mycoccus lactis. Candida tropicalis, Candida guilliermondii). Применение данного способа для очистки почвы и воды позволило установить, что, во-первых, эффективность его невысока в случае очистки морской воды; во-вторых, консорциум применяемых культур затрудняет процесс производства препарата в заданном технологическом режиме; в-третьих, эффективность применения препарата в значительной степени зависит от внешней температуры (ниже 26^oC резко снижалась интенсивность биодеструкции нефтепродуктов), что удлиняет срок биоочистки; в-четвертых, состав консорциума включает микроорганизмы различной таксономической и видовой принадлежности (дрожжи и бактерии), характеризующиеся различными физико-химическими параметрами роста и конкурентными взаимоотношениями по субстрату, что затрудняет поддержание их заданного соотношения в биоценозе, это безусловно снижает эффективность очистки (по данным авторов она колеблется в пределах 60 99%); в-пятых, очистки от нефтепродуктов осуществляется только в водной фазе и только в периодическом режиме культивирования, что ограничивает область применения данного способа.

Технический результат предлагаемого способа заключается в повышении эффективности очистки различных объектов от нефтяных загрязнений за счет интенсификации процесса деструкции на основе использования природных сапрофитных бактерий, характеризующихся высокой нефтеокисляющей активностью, при одновременном обеспечении экологической безопасности. Данный технический результат достигается тем, что в способе микробиологической очистки объектов от нефтяных загрязнений, включающем внесение биомассы сапрофитной бактериальной культуры природного штамма в очищаемый объект, в качестве природного штамма используют Acinetobacter sp. (bicoccum) B-6445 или Rhodococcus sp. S-1213, или Arthrobacter sp. S-1212, при этом соотношение расхода биомассы к нефтяным загрязнениям составляет 1:10² 10⁵ в зависимости от условий и степени загрязнения.

Одним из основных приемов предлагаемого способа и достижения технического результата является использование штаммов нефте- и углеводородокисляющих бактерий Acinetobacter sp. (bicoccum) B-6445 или Rhodococcus sp. S-1213, или Arthrobacter sp. S-1212, селекционированных в условиях непрерывного процесса культивирования на минеральной среде с сырой нефтью или н-парафинами, в котором засевным материалом служил активный ил очистных сооружений Уфимского нефтеперерабатывающего завода.

Данные штаммы широко распространены в природе, обладают высокой окислительной способностью по отношению к широкому спектру углеводородов различного химического строения и характеризуются свойством быстрой приживаемости в природных ценозах. Видовая принадлежность установлена по "Определителю бактерий Берги" (под ред. Дж. Хоулта. М. Мир, 1980) и "Определителю бактерий и актиномицетов" (Н.А. Красильников, М.-Л. Изд. АН СССР, 1949).

Штаммы Acinetobacter sp. (bicoccum) B-6445, Rhodococcus sp. (S-1213), Arthrobacter sp. (S-1212) хранятся во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов ВКПМ.

Перечисленные штаммы хемоорганотрофы; облигатные аэробы (метаболизм дыхательный); температура роста 10 45^oC pH среды 3,0 8,0; потребность в витаминах и дополнительных факторах роста отсутствует, но при наличии в среде биотина или дрожжевого автолизата активность роста повышается. В качестве единственного источника азота используют минеральный азот; гемолитической активностью не обладают. Штаммы в качестве единственного источника углерода усваивают широкий спектр углеводородов, входящих в состав нефти: н-алканы C₈-C₃₈, циклоалканы, ароматические углеводороды, асфальтены, неочищенные жидкие смеси парафинов, смолистые вещества, нефтемасла, дизельные фракции, мазут и сырую нефть (всего более 25 компонентов сырой нефти).

Штаммы непатогенны и нетоксичны.

Бактерии Acinetobacter sp. (bicoccum) B-6445 грамотрицательные. Клетки на мясопептонном агаре (МПА) (3-суточная культура) кокковой формы, неподвижные. Колонии на МПА (3-суточная культура) округлые с ровным краем, беловатые, блестящие. Спор не образуют. Оптимальная температура роста 35 45^oC.

Бактерии Rhodococcus sp. S-1213 грамположительные, клетки на МПА (3-суточная культура) одиночные короткоовальной формы и палочки, варьирующие по форме и величине. Колонии на МПА (3-суточная культура) округлые с ровным краем, беловатые с блеском, равномерно возвышенные. Растут в присутствии 5 - 10% хлористого натрия. Температура роста 15 43^oC.

Бактерии Arthrobacter sp. S-1212 грамвариабельные в зависимости от морфологии клеток, которая может меняться: кокковидные клетки грамположительные, палочки грамотрицательные. Клетки на МПА (3-суточная культура) палочковидной неправильной формы, которые варьируют по величине и форме, часто расположены под углом друг к другу, образуя V-образные формы. Способны расти при температуре 10 15^oC; оптимальная температура роста 10 40^oC. Колонии на МПА (3-суточная культура) округлые с ровным краем, беловатые с блеском, равномерно выпуклые.

Для получения активной биомассы штаммы бактерий выращивают в непрерывном или периодическом режимах на жидкой минеральной среде следующего состава, г/л: NH₄H₂PO₄ 10; K₂HPO₄ 10; MgSO₄ · 7H₂O 0,7; ZnSO₄ · 7H₂O 0,0125; FeSO₄ · 7H₂O 0,0125; MnSO₄ · 7H₂O 0,0125; сырая нефть или н-парафины 2% (объемн.). Активность роста штаммов по накоплению биомассы при росте на сырой нефти 8 13 г/л (в зависимости от температуры) и при росте на н-парафинах 7 12 г/л (в зависимости от температуры).

Для наработки бактериальной биомассы пригодно стандартное оборудование, применяющееся в различных отраслях микробиологической промышленности (производстве пекарских дрожжей, ферментных препаратов, живых вакцин и т.п. ).

Получаемая бактериальная биомасса используется в предлагаемом способе в виде трех модификаций: 1) рабочая суспензия с концентрацией 7 13 г/л АСБ; 2) сгущенная биомасса в виде пасты; 3) порошок, получаемый на распылительной сушилке или лиофильной установке.

Первые два вида бактериальной биомассы применимы в местах, непосредственно приближенных к предприятиям по ее производству. Срок годности такой биомассы составляет (при температуре <15C) до 8 месяцев. Биомасса в высушенном состоянии имеет срок годности не менее 2 лет; она представляет собой мелкодисперсный слегка комковатый порошок желтовато-серого цвета; хорошо сохраняется в бумажных крафт-мешках в сухом месте при пониженной (но не отрицательной!) температуре.

Порошкообразная биомасса перед применением смешивается в воде с вышеуказанными минеральными компонентами до гомогенного состояния либо без минеральных компонентов в зависимости от объекта. Расчет оптимальных доз минеральных добавок (источников азота, фосфора, калия и магния) основан на определении концентраций доступных форм элементов в природном объекте и вычислении недостающего их количества. В качестве минеральных добавок также можно использовать мочевину, сульфат аммония, суперфосфат, аммофос, калия магнезию, азофоску.

Другим основным приемом предлагаемого способа является количество используемой бактериальной биомассы в зависимости от условий и степени нефтезагрязнения.

Так, например, расход бактериальной биомассы на почве или воде определяется количеством нефтезагрязнения и погодными условиями. Так, если на 10000 м² почвы или поверхности воды разлито 5 25, 26 100 и 100 250 т нефти или нефтепродуктов, то соответствующие дозы сухой биомассы составляют 1,5 5,0; 5,0 10; 10 15 кг, т.е. соотношение расхода биомассы к нефти составляет 1:10² 10⁵. При засухе требуется дополнительный полив почвы в вечернее время.

Обработка загрязненных участков почвы, воды, емкостей и других объектов осуществляется с помощью различных технологических машин, агрегатов, пожарных поездов, вертолетов или самолетов.

Разработанная технология предполагает обработку почвы in situ, т.е. без снятия слоев почвы, хотя в некоторых случаях необходимо проводить ее рыхление (загрязненный песок, гравий, почва, пропитанная нефтью).

Очистка водоемов предполагает нанесение бактериальной биомассы на загрязненную поверхность и создание условий для перемешивания образующейся эмульсии.

Очистка емкостей осуществляется внесением суспензии, приготовленной заранее, и пропусканием воздуха через водно-нефтяную смесь при добавлении минеральных компонентов.

Основа технологии применения бактериальной биомассы заключается в создании условий для резкого увеличения концентрации углеводородокисляющих микроорганизмов в местах нефтяного загрязнения с целью резкого ускорения биохимической деструкции нефтепродуктов и восстановления естественного биоценоза.

В процессе жизнедеятельности микроорганизмов углеводороды, утилизируемые ими, превращаются в клеточные вещества (белки, липиды, нуклеиновые кислоты, углеводы) и углекислый газ, которые затем включаются в общий цикл круговорота веществ в биосфере. После завершения очистки от нефтепродуктов образовавшаяся биомасса под воздействием регуляторных трофических механизмов включается в цикл естественных микробиоценозов, а избыточное ее количество отмирает, превращаясь под воздействием сапрофитной микрофлоры в гумусовые вещества почвы или в полноценную белково-витаминную массу, потребляемую водной фауной.

Совместимость селекционированных культур, относящихся к группе чрезвычайно широко распространенных в природе бактерий, с другими почвенными микроорганизмами открывает перспективу создания серий биопрепаратов, приуроченных к очистке территорий с конкретными физико-химическими и биологическими параметрами.

Ниже приведены сведения, подтверждающие возможность осуществления предлагаемого изобретения.

Пример 1.

Резервуар высотой 150 см и диаметром 50 см заполнен 200 л воды, содержащей 4% морской соли. На поверхность воды помещен 1 кг сырой нефти (Нижневартовского месторождения), создающей пленку толщиной 5 мм. В резервуар добавлено 20 г бактериальной биомассы в виде порошка (культура Rhodococcus sp. S-1213), т.е. соотношение биомассы к нефти 1:10². Содержимое резервуара перемешивается с помощью барботажа воздухом. Через 2 суток содержание н-алканов снизилось на 92,4% ароматических углеводородов на 90,1% Процесс полной очистки (100%) завершен в течение 7 суток.

Пример 2.

Имеется 200-литровая емкость, загрязненная на днище и стенках 3 кг нефтепродуктов (мазут). Проведена механическая мойка водой (100 л), в которую добавили суспензию бактериальной биомассы Acinetobacter sp. (bicoccum) B-6445 в концентрации 0,1 г АСМ/л, т.е. соотношение биомассы к мазуту 1:10³. Добавлены минеральные соли следующего состава, г/л: NH₄H₂PO₄ 10; K₂HPO₄ 10; MgSO₄ · 7H₂O 0,7. Через 2 суток содержание н-алканов уменьшилось на 93,7% ароматических углеводородов - на 89,6% Полная очистка (100%) была завершена через 8 суток.

Пример 3.

Участок почвы площадью 1 га загрязнен сырой нефтью (Рузаевская нефтебаза) в количестве 12,5 кг/м² (т.е. 12,5 т). После однократной обработки бактериальной биомассой в виде суспензии (культура Arthrobacter ap. S-1212) в количестве 12 кг АСБ, т.е. при соотношении биомассы к нефти 1:10³, через 7 суток на поверхности почвы визуально наблюдаются следующие изменения: маслянистая поверхность становится матовой, пронизывается мелкими порами за счет выделения углекислого газа, цвет меняется от черного до серого и затем темно-желтого. Агрегатный состав почвы из вязкой илообразной консистенции становится комковатым с характерным гнилостным запахом. Через 14 сут. комочки почвы не горючи, через 21 сут. нефтепродукты при химическом анализе не обнаруживаются, состав микрофлоры восстанавливается. Очистка составила практически 100% Пример 4.

Водоем Рузаевской нефтебазы площадью 1 га содержит 183 т сырой нефти. После однократной обработки водоема суспензией бактериальной биомассы Arthrobacter sp. S-1212, содержащей 12 кг АСМ, т.е. соотношение биомассы к нефти составило 1:10⁵, через 7 сут. на поверхности появляются вздутия, обусловленные выделением углекислого газа. Пленка становится последовательно бурой, темно-красной, светло-оранжевой и распадается на быстро исчезающие фрагменты, пронизанные белесыми скоплениями микробной массы. Через 20 сут. пленка исчезла (100% очистка), прозрачность воды полностью восстановилась через 30 сут.

Пример 5.

Имеется амбар-отстойник площадью 300 м², толщина слоя нефтепpодуктов (смолистые вещества, асфальтены, сырая нефть 1,0 1,5 см, т.е. загрязнение нефтепродуктами составило 558 кг. Однократная обработка бактериальной суспензией Acinetobacter sp. (bicoccum) B-6445, содержащий 2,5 кг АСБ (соотношение биомассы к нефтепродуктам 1:10³), 5 кг суперфосфата и 3 кг сульфата аммония, позволила полностью (на 100%) очистить хранилище через 21 сутки.

Пример 6.

Проведена очистка 36 л воды, загрязненной сырой нефтью (2% объемн. т.е. 670 г нефти), в условиях непрерывного глубинного процесса культивирования (при скорости протока Д 0,2 час^-1) в аппарате интенсивного массообмена "Биостат" с помощью культуры Acinetobacter sp. (bicoccum) B-6445 при добавлении минеральных солей следующего состава, г/л: H₃PO₄ (70%) 52 мл; KCl 49; MgSO₄ · 7H₂O 35; FeSO₄ · 7H₂O 6,7; ZnSO₄ · 7H₂O 1,45; MnSO₄ · 5H₂O 0,85. Засевной материал в виде бактериальной биомассы составил 1 г АСБ при рабочем объеме 1,5 л, т.е. соотношение расхода биомассы к нефти составило 1:10³. Загрязненная вода была очищена за 5 суток, степень очистки составила 94,9% Как видно из приведенных примеров, технологический результат от использования данного способа достигается за счет внесения бактериальной биомассы природных штаммов Acinetobacter sp. (bicoccum) B-6445 (или Rhodococcus sp. S-1213, или Arthrobacter sp. S-1212), при этом расход биомассы к нефтепродуктам составляет 1:10² 10⁵. При внесении на загрязненный объект биомассы ниже данного соотношения срок очистки удлиняется, расход биомассы в соотношении выше максимального нецелесообразен, так как эффективность очистки не повышается, а затраты на очистку увеличиваются.

Приведенные примеры также показали, что предлагаемый способ очистки объектов от нефтезагрязнений повышает эффективность очистки за счет стабилизации процесса деструкции на уровне 90 100% Таким образом, на основании полученных результатов предлагаемый способ характеризуется следующими преимуществами по сравнению с прототипом: в данном способе используют природные непатогенные штаммы бактерий Acinetobacter sp. (bicoccum) B-6445 или Rhodococcus sp. S-1213, или Arthrobacter sp. S-1212, характеризующиеся широким спектром углеводородокисляющей активности (т.е. утилизацией сырой нефти и ее компонентов в широком диапазоне температуры 10 45^oC); способ характеризуется высокой эффективностью очистки за счет стабилизации интенсивности деструкции нефтяных загрязнений на уровне 90 100% при высокой степени загрязнения, что позволит интенсифицировать процесс рекультивации сельскохозяйственных земель и очистку рыбохозяйственных водоемов, т. е. осуществить возврат земель и водоемов в народнохозяйственной использование при одновременном обеспечении "оздоровления" окружающей среды; способ характеризуется малым расходом биомассы, составляющим по отношению к нефтяным продуктам 1:10² 10⁵; способ характеризуется широкой областью применения для очистки почвы, воды (в том числе морской), емкостей и т.д.

способ характеризуется экологической безопасностью, так как вносимая бактериальная биомасса не требует применения каких-либо дополнительных веществ: в случае использования минеральных солей последние полностью потребляется в процессе метаболизма бактерий; сама бактериальная биомасса включается в естественный биоценоз почвы, улучшая ее агротехническое состояние, либо служит дополнительным источником планктонного питания в случае очистки водоемов; исключается также загрязнение грунтовых вод, так как предлагаемые природные штаммы бактерий являются облигатными аэробами, погибающими в отсутствии кислорода.

По данному способу были проведены натурные испытания на Рузаевской нефтебазе Мордовии. Эффективность очистки составила 90 100% Экономический эффект от применения данного способа складывается как из высокой эффективности очистки от нефтезагрязнений, так и улучшения экологического состояния окружающей среды.

Формула изобретения

Способ микробиологической очистки объектов от нефтяных загрязнений, включающий биомассы сапрофитной бактириальной культуры природного штамма в очищаемый объект, отличающийся тем, что в качестве природного штамма используют Acinctobacter sp. (bicoccum) ВКПМ В-6445, или Rhodococcus sp. ВКПМS -1213, или Arthrobacter sp. S-1212 при соотношении биомассы к нефтяным загрязнениям 1 10² 1 10⁵ в зависимости от условий и степени загрязнения.