Способ получения фитотоксина из культуры гриба drechslera graminea

 

Использование: Биотехнология и может быть использовано в производстве фитотоксинов для селекции зерновых культур на устойчивость к фитопатогенам. Сущность изобретения: В способе получения фитотоксина из культуры гриба D. graminea проводят промывание пораженных грибом листьев, их высушивание и разрезание на участки, затем культивируют мицелий гриба на жидкой питательной среде непосредственно из пораженных участков листа с последующим выделением из культурального фильтрата фитотоксина.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в производстве фитотоксинов.

Известен способ получения гельминтоспораля из H.sativum, который включает приготовление посевного материала на агаровой среде, пассирование спор и мицелия гриба на жидкую питательную среду и культивирование на данной среде с последующим извлечением фитотоксина. (Phytopathologi Z, 1978, вып. 92, N 3, р.202-210).

Наиболее близким аналогом является способ получения фитотоксина из культуры гриба, включающий промывание пораженных листьев, их высушивание фильтровальной бумагой, разрезание на участки, культивирование мицелия гриба на жидкой питательной среде и выделение из культурального фильтрата фитотоксина. (Методы экспериментальной микологии. Справочник под ред. В. И. Билай, Наукова думка, 1982, с. 296).

Однако оба способа включают пассирование мицелия гриба на жидкую питательную среду, в результате чего снижаются патогенные свойства большинства грибов, выражающиеся в уменьшении ингибирующей способности культурального фильтрата и фитотоксина.

Повышенной неустойчивостью отличается гриб D.graminea: после пассирования плохо размножается, дает слабый прирост мицелиальной массы и, следовательно, низкий выход токсина с плохой ингибирующей способностью.

Задача, которую необходимо решить, заключается в следующем: 1) повысить выход фитотоксина гриба D.graminea; 2) увеличить ингибирующую способность фитотоксина указанного гриба.

Поставленная задача решена с помощью предлагаемого способа получения фитотоксина из культуры гриба D.graminea, включающего промывание пораженных листьев, их высушивание фильтровальной бумагой, разрезание на участки, культивирование мицелия гриба на жидкой питательной среде и выделение из культурального фильтрата фитотоксина, причем высушивание и разрезание выполняют сразу после промывания, а культивирование проводят непосредственно из пораженных участков листа.

В результате использования предлагаемого способа повышается выход фитотоксина гриба D.graminea и увеличивается его ингибирующая способность.

Возможность осуществления способа подтверждается примерами конкретного выполнения.

Пример 1.

Для подготовки посевного материала больные полосатой пятнистостью (возбудитель D.graminea) листья ячменя промывают 2-3 часа в проточной водопроводной воде, стерилизуют в 5% растворе беласепта в течение 12 минут и промывают 3 раза стерильной водой.

Кусочки листьев высушивают стерильной фильтровальной бумагой и раскладывают по 1 штуке в чашки Петри на поверхность агаровой среды следующего состава: Крахмал 0,3% KH₂PO₄ 0,02% Ca(NO₃)₂ 0,02% Пептон 0,02% Агар 2% Стрептомицин 0,1% Выращивают при температуре 20^o С в течение 5-7 суток в темноте до полного заполнения мицелием агаризованной питательной среды. Затем для получения конидий 7-суточную мицелиальную массу в открытых чашках помещают в лабораторную установку с люминесцентными лампами на 5-7 часов, не допуская подсыхания среды.

Для культивирования гриба готовят жидкую питательную среду следующего состава:
NH₄Cl 1,06 г
KH₂PO₄ 1,0 г
MgSO₄ 0,5 г
KCl 0,5 г
сахароза 20,0 г
(лабораторный регламент лаборатории молекулярных основ иммунитета растений ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии, Фадеев Ю. Н. 1988). В 4 колбы объемом 500 мл наливают 200 мл среды, стерилизуют при р=1,0 атм в течение 30 минут, охлаждают и пинцетом или скальпелем переносят в каждую 3-4 кусочка мицелия с конидиями объемом до 0,5 см³. Колбы помещают на круговые качалки (220 об. /мин) и культивируют 15-18 суток при температуре 24^oС. После этого культуральную жидкость отделяют через бумажный фильтр от мицелия гриба. Из полученного в объеме 540 мл культурального фильтрата 15 мл берут для определения ингибирующей способности. Ингибирующая способность культурального фильтрата на суточных проростках семян ячменя в разведении фильтрата водой 1: 1:
1 закладка опыта 18,4
2 закладка опыта 25,5%
Из оставшихся 525 мл с помощью растворителя этилацетата извлекают фитотоксин.

Масса фитотоксина:
1 закладка 0,9530 г
2 закладка 0,9492 г
Определение ингибирующей способности фитотоксина проводят на суточных проростках семян ячменя при дозе фитотоксина 100 мкг/мл.

1 закладка 21,6%
закладка 17,8%
Пример 2.

В качестве посевного материала используют листья растений ячменя, пораженные полосатой пятнистостью (возбудитель D.graminea), промывают их в проточной воде в течение 2-3 часов, обсушивают стерильной фильтровальной бумагой и разрезают на кусочки размерами от 0,2 до 0,5 мм₂. Подготовленный таким образом посевной материал по 3-4 кусочка помещают в колбы с жидкой питательной средой. Культивирование проводится как в примере 1, на той же среде.

Ингибирующая способность культурального фильтрата:
1 закладка 52,6%
2 закладка 27,8%
Масса фитотоксина:
1 закладка 0,9836 г
2 закладка 0,9581 г
Ингибирующая способность фитотоксина:
1 закладка 41,7%
2 закладка 37,5%
Получение фитотоксина из культуры гриба D.graminea предложенным способом позволяет повысить выход фитотоксина, который в то же время обладает большей ингибирующей способностью.

Формула изобретения

Способ получения фитотоксина из культуры гриба Drechslera graminea, включающий промывание пораженных листьев, их высушивание фильтровальной бумагой, разрезание на участки, культивирование мицелия гриба на жидкой питательной среде и выделение из культурального фильтрата фитотоксина, отличающийся тем, что высушивание и разрезание выполняют сразу после промывания, а культивирование проводят непосредственно из пораженных участков листа.