Способ изготовления вакцины против лептоспироза животных

 

Использование: биотехнология, вакцина против лептоспироза животных. Сущность изобретения: культуру лептоспир выращивают при 27 - 29^oC в течение 72 - 90 ч и парциальном давлении растворенного кислорода в пределах 15 - 20% от насыщения кислородом воздуха. Для культивирования используют жидкую питательную среду на твин-альбуминовой основе, при следующем соотношении компонентов, мас.%: альбумин сухой 0,15 - 0,3; неонол или твин-80 0,01 - 0,03; L-аспарагин 0,1 - 0,5; фторурацил 0,01 - 0,025; пролин 0,03 - 0,05; глутамин 0,025 - 0,045; витамин B₁ 0,03 - 0,05; витамин B₁₂ 0,01 - 0,025; натрий фосфорнокислый двузамещенный 15,6 - 17,6; калий фосфорнокислый однозамещенный 1,17 - 3,17; вода дистиллированная до 100,0. Причем после засева лептоспир окислительно-восстановительный потенциал снижают до 180 - 200 мВ, а концентрацию неонола или твина-80 поддерживают на уровне 0,01 - 0,03 маc.% на протяжении всего процесса культивирования. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве вакцины против лептоспироза животных.

Известны способы получения поливалентной вакцины против лептоспироза животных [1, 2, 3] Однако существующие способы изготовления вакцины обладают рядом недостатков.

Используемая сывороточная питательная среда и рутинный способ культивирования лептоспир в стеклянной посуде не отвечают требованиям современного индустриального производства препарата, не обеспечивают высокого накопления бактериальной массы 70 100 млн/мл для получения высокоиммуногенной, стабильной и эффективной вакцины.

Применение стеклянных бутылей для культивирования лептоспир представляет весьма трудоемкий и тяжелый ручной труд. Многочисленные операции с бутылями при монтаже, при фильтровании среды, при посеве культуры лептоспир, при просмотре культуры на накопление, при перекачке культуры лептоспир для составления серии вакцины и др. приводит к контаминации отдельных бутылей посторонней микрофлорой, а в конечной итоге к удорожанию и снижению качества препарата. В настоящее время сказывается нехватка стеклянной посуды, ее дороговизна и относительно короткий срок эксплуатации.

Трудоемки и не надежны в промышленном производстве также процессы стерилизующего фильтрования среды и концентрирования баксуспензии (в следствие низкого накопления бактериальной массы).

Многолетний опыт показал, что основным недостатком сывороточной среды является содержание (у значительной части овец-доноров) специфических антител к производственным штаммам лептоспир, что приводит к снижению накопления этих микроорганизмов и изменению их антигенной структурны, а это в конечном итоге к снижению качества вакцины.

Наиболее близким аналогом является способ изготовления вакцины против лептоспироза животных, включающий посев лептоспир в синтетическую среду, содержащую аминокислоты, витамины В₁ и В₁₂, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, ПАВ (твин-80) и дистиллированную воду. Культивирование проводят в условиях аэрации и перемешивания с периодическим внесением твина-80 в процессе культивирования. Полученную бактериальную массу инактивируют и добавляют адъювант [4] Цель изобретения получение высокого накопления бактериальной массы при культивировании лептоспир в биореакторе, повышение иммуногенности, стабильности и эффективности вакцины, а также снижение себестоимости препарата.

Цель достигается за счет использования разработанной бессывороточной питательной среды на твин-альбуминовой основе и разработанного режима культивирования лептоспир.

Кроме того, введение в состав питательной среды пролина, аспарагина и глутамина позволяет получать максимальное накопление лептоспир, а добавление фторурацила подавляет рост посторонней микрофлоры, не влияя на рост лептоспир, и обеспечивает чистоту культуры.

Способ осуществляется следующий образом.

В стерильные биореакторы загружают жидкую оптимизированную по составу для лептоспир (ВГНКИ-1, ВГНКИ-2, ВГНКИ-3, ВГНКИ-4, ВГНКИ-5, ВГНКИ-6) питательную среду, приготовленную по следующей прописи, мас.

Альбумин сухой 0,15 0,3 Твин-80 (неонол) 0,01 0,03 L аспарагин 0,1 0,5 Фторурацил 0,01 0,025 Пролин 0,03 0,05 Глутамин 0,025 0,045 Витамин В₁ 0,03 0,05 Витамин В₁₂ 0,01 0,025 Натрий фосфорнокислый (Na₂HPO₄) 15,6 17,6
Калий фосфорнокислый (KH₂PO₄) 1,17 3,17
Вода дистиллированная до 100,0.

Готовая стерильная питательная среда должна содержать 0,15 0,3% белка и иметь 7,35 7,55 ед. pH.

Питательную среду в отдельном ферменте засевают матровой расплодкой лептоспир, выращенной в течение 5 сут (120 ч) в жидкой питательной среде с сывороткой крови (5%) и культивируют каждый штамм в отдельном биореакторе при 27 29^oC в течение 72 90 ч.

После засева окислительно-восстановительный потенциал снижают до 200 - 180 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и включенной мешалке. Затем с помощью изменения расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки до 120 об/мин поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 15 20% от насыщения кислородом воздуха, pH культуральной жидкости в процессе культивирования изменяется незначительно и его не регулируют. Через 48 ч культивирования дробную подачу раствора твин-80 (неонола) осуществляют дозами до концентрации 0,01 0,03% при лимитировании роста лептоспир, характеризующимся резким повышением pO₂ при неизменных оборотах мешалки и количества подаваемого в реакторы воздуха. Выращенные культуры лептоспир инактивируют формалином, смешивают между собой в одинаковых объемах, добавляют адъювант и стерильно фасуют во флаконы.

Пример 1. Способ изготовления с минимальными значениями параметров.

В стерильные биореакторы отдельно для каждого штамма загружают в жидкую оптимизированную по составу для лептоспир питательную среду, приготовленную по следующей прописи, мас.

Альбумин сухой 0,15
Твин-80 (неонол) 0,01
L аспарагин 0,1
Пролин 0,03
Глутамин 0,025
Фторурацил 0,01
Витамин B₁ 0,03
Витамин B₁₂ 0,01
Натрий фосфорнокислый (Na₂HPO₄) 15,6
Калий фосфорнокислый (KH₂PO₄) 1,17
Вода дистиллированная До 100,0
Готовая стерильная питательная среда содержит 0,15% белка и имеет 7,35 ед pH. Питательную среду в отдельных биореакторах для каждого штамма засевают матровой расплодкой лептоспир, выращенной в жидкой питательной среде указанного состава в течение 5 сут (120 ч) и культивируют каждый штамм в отдельном биореакторе при 27^oC в течение 72 ч.

После засева окислительно-восстановительный потенциал снижают до 200 мB путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке. Затеи с помощью изменения расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки до 120 об./мин поддерживают парциальное давление растворенного в культурной жидкости кислорода на уровне 15% от насыщения кислородом воздуха. Через 48 ч культивирования дробную подачу раствора твина-80 (неонола) осуществляют дозами до концентрации 0,01% при лимитировании роста лептоспир, характеризующимся резким повышением pO₂ при неизменных оборотах мешалки и количества подаваемого в реакторы воздуха. Накопление лептоспир после 72 ч культивирования составляет 1 млрд/с³.

Выращенные культуры лептоспир инактивируют формалином в концентрации 0,2% от общего объема, антигены смешивают между собой в равных количествах, добавляют 6% -ный гидрат окиси алюминия в количестве 30% от общего объема и стерильно фасуют во флаконы,
Пример 2. Способ изготовления вакцины с оптимальными значениями параметров. В стерильные биореакторы отдельно для каждого штамма загружают жидкую оптимизированную по составу для липтоспир питательную среду, приготовленную по следующей прописи, мас.

Альбумин сухой 0,22
Твин-80 (неонол) 0,02
L аспарагин 0,3
Фторурацил 0,018
Пролин 0,04
Глутамин 0,035
Витамин B₁ 0,04
Витамин B₁₂ 0,018
Натрий фосфорнокислый (Na₂HPO₄) 16,6
Калий фосфорнокислый (KH₂PO₄) 2,17
Вода дистиллированная До 100,0
Питательная среда содержит до 0,22% белка и имеет 7,45 ед. pH.

Питательную среду в отдельных биореакторах засевают матровой расплодкой лептоспир, выращенной в жидкой питательной среде аналогичного состава в течение 120 ч.

Культивируют каждый штамм отдельно при 28^oC в течение 81 ч.

После засева окислительно-восстановительный потенциал снижают до 190 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке. Затем с помощью изменения подачи воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки до 120 об/мин поддерживают парциальное давление растворенного в культурной жидкости кислорода на уровне 17,5% от насыщения кислородом воздуха. Через 48 ч культивирования дробную подачу раствора твина-80 (неонола) осуществляют дозами до концентрации 0,02% при лимитировании роста лептоспир, характеризующимся резким повышением pO₂ при неизменных оборотах мешалки и количества подаваемого в реактор воздуха. Накопление лептоспир после 81 ч культивирования составляет 2 млрд/см³.

Выращенные культуры лептоспир инактивируют формалином в концентрации 0,2% от общего объема, смешивают антигены между собой в равных количествах, добавляют 6%-ый гель гидрата окиси алюминия в количестве 30% от общего объема, перемешивают и стерильно фасуют во флаконы.

Пример 3. Способ изготовления вакцины с максимальными значениями параметров. В стерильные биореакторы отдельно для каждого штамма загружают жидкую оптимизированную по составу для лептоспир питательную среду, приготовленную по следующей прописи, мас.

Альбумин сухой 0,3
Твин-80 (неонол) 0,03
L аспарагин 0,5
Фторурацил 0,025
Пролин 0,05
Глутамин 0,045
Витамин В₁ 0,05
Витамин B₁₂ 0,025
Натрий фосфорнокислый (Na₂HPO₄) 17,6
Калий фосфорнокислый (KH₂PO₄) 3,17
Вода дистиллированная До 100,0
Питательная среда содержит 0,3% белка и имеет 7,55 ед.pH.

Питательную среду в отдельных биореакторах для каждого штамма засевают матровой расплодкой лептоспир, выращенной в жидкой питательной среде указанного состава в течение 120 ч и культивируют каждый штамм в отдельном биореакторе при 29^oC в течение 90 ч.

После засева окислительно-восстановительный потенциал снижают до: 180 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке. Затем с помощью изменения расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки до 120 об. /мин поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 20% от насыщения кислородом воздуха. Через 48 ч культивирования дробную подачу раствора твин-80 (неонола) осуществляют дозами до концентрации 0,03% при лимитировании роста лептоспир, характеризующимся резким повышением pO₂ при неизменных оборотах мешалки и количества подаваемого в реакторы воздуха. Накопление лептоспир после 90 ч культивирования составляет 1,5 млрд/см³
Выращенные культуры лептоспир инактивируют формалином в концентрации 0,2% от общего объема, смешивают антигены между собой в равных объемах, добавляют 6%-ый гель гидрата окиси алюминия в количестве 30% от общего объема, перемешивают и стерильно фасуют во флаконы.

Пример 4. Способ изготовления вакцины со значениями параметров ниже минимальных. В стерильные биореакторы отдельно для каждого штамма загружают жидкую питательную среду, приготовленную по следующей прописи, мас.

Альбумин сухой 0,1
Твин-80 (неонол) 0,005
L аспарагин 0,05
Фторурацил 0,005
Пролин 0,02
Глутамин 0,015
Витамин B₁ 0,02
Витамин B₁₂ 0,005
Натрий фосфорнокислый (Na₂HPO₄) 14,5
Калий фосфорнокислый (KH₂PO₄) 0,99
Вода дистиллированная До 100,0
Готовая питательная среда содержит 0,10% белка и имеет 7,30 ед. pH
Питательную среду в отдельных биореакторах засевают матровой расплодкой лептоспир, выращенной в жидкой питательной среде указанного состава в течение 120 ч. Культивируют каждый штамм лептоспир в отдельном биореакторе при 26^oC в течение 70 ч.

После засева окислительно-восстановительный потенциал снижают до 210 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке. Затем с помощью изменения расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки до 120 об./мин поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 12,5% от насыщения кислородом воздуха. Через 48 ч культивирования дробную подачу раствора твин-80 (неонола) осуществляют дозами до концентрации 0,005% при лимитировании роста лептоспир характеризующимся резким повышением рО₂ при неизменных оборотах мешалки и количества подаваемого в реакторы воздуха. В полученной культуре наблюдали полиморфизм. Накопление лептоспир после 70 ч культивирования составляет не выше 0,15 млрд клеток/мл.

Выращенные культуры лептоспир инактивируют формалином в концентрации 0,2% от общего объема, смешивают антигены лептоспир между собой в равных объемах, добавляют 6% -ый гель гидрата окиси алюминия в количестве 30% от общего объема, перемешивают и стерильно фасуют во флаконы.

Пример 5. Способ изготовления вакцины со значениями параметров выше максимальных. В стерильные биореакторы отдельно для каждого штамма загружают жидкую питательную среду, приготовленную по следующей прописи, мас.

Альбумин сухой 0,4
Твин-80 (неонол) 0,04
L аспарагин 0,6
Фторурацил 0,035
Пролин 0,055
Глутамин 0,055
Витамин В₁ 0,06
Витамин В₁₂ 0,03
Натрий фосфорнокислый (Na₂HPO₄) 18,6
Калий фосфорнокислый (KH₂PO₄) 4,17
Вода дистиллированная до 100,0
Готовая питательная среда содержит 0,4% белка и имеет 7,60 ед. pH.

Питательную среду в отдельных биореакторах для каждого штамма засевают матровой расплодкой лептоспир, выращенной в течение 120 ч в жидкой питательной среде указанного состава и культивируют при 30^oС в течение 92 ч.

После засева окислительно-восстановительный потенциал снижают до 170 мВ путем выдержки культуры без подачи воздуха на аэрацию и выключенной мешалке. Затем с помощью изменений расхода воздуха на аэрацию и скорости вращения мешалки до 120 об./мин поддерживают парциальное давление растворенного в культуральной жидкости кислорода на уровне 22,5% от насыщения кислородом воздуха. Через 48 ч культивирования дробную подачу раствора твин-80 (неонола) осуществляют дозами до концентрации 0,04% при лимитировании роста лептоспир, характеризующимся резким повышением рО₂ при неизменных оборотах мешалки и количества подаваемого в реакторы воздуха. В полученной культуре наблюдали полиморфизм. Накопление лептоспир после 92 ч культивирования составляет 0,3 млрд/см³.

Выращенные культуры лептоспир инактивируют формалином в концентрации 0,2% от общего объема, смешивают антигены между собой в равных количествах, добавляют 6%-ый гель гидрата окиси алюминия в количестве 30% от общего объема, перемешивают и стерильно фасуют во флаконы.

Технологические параметры культивирования лептоспир и сравнительные данные изготовления вакцины против лептоспироза животных, указанные в примерах, а также активность готового препарата, приведены в таблице.

Таким образом использование принципиально новой бессывороточной питательной среды на твин-альбуминовой основе и разработанного режима культивирования позволяет значительно увеличить накопление бактериальной массы при изготовлении вакцины против лептоспироза животных, а также повысить стабильность и срок годности препарата.

Источники информации:
1. Авторское свидетельство СССР N 555664, кл. А 61 К 39/00, 1983 г.

2. Авторское свидетельство СССР N 828459, кл. А 61 К 39/02, C 12 N 5/00, 1983 г.

3. Инструкция по изготовлению и контролю поливалентной вакцины "ВГНКИ" против лептоспироза животных, утв. 06.03.84.

4. Малахов Ю.А. Лептоспироз животных, М. ВО Агропромиздат, 1992, с.31-33.

Формула изобретения

Способ изготовления вакцины против лептоспироза животных, включающий посев лептоспир, их культивирование в жидкой питательной среде, содержащей аминокислоты и витамины В₁ и В₁₂, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, ПАВ и дистиллированную воду, в условиях аэрации и перемешивания, внесение ПАВ в процесс культивирования с последующей инактивацией бактериальной массы и добавлением адъюванта, отличающийся тем, что после посева окислительно-восстановительный потенциал снижают до 180 200 мВ, культивирование проводят в течение 72 90 ч при температуре 27 29^oС и парциальном давлении растворенного кислорода в пределах 15 20% от насыщения кислородом воздуха в питательной среде, дополнительно содержащей альбумин сухой, фторурацил, из аминокислот - L-аспарагин, пролин, глутамин, из ПАВ неонол или твин-80, при следующем соотношении компонентов, мас.

Альбумин сухой 0,15 0,3
Неонол или твин-80 0,01 0,03
L-аспарагин 0,1 0,5
Фторурацил 0,01 0,025
Пролин 0,03 0,05
Глутамин 0,025 0,045
Витамин В₁ 0,03 0,05
Витамин В₁₂ 0,01 0,025
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 15,6 17,6
Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,17 3,17
Вода дистиллированная До 100,0
при этом концентрацию ПАВ поддерживают на уровне 0,01 0,03 мас. на протяжении всего процесса культивирования.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3