Способ выделения гликозаминогликанов из фиброзного хряща

 

Изобретение относится к клинической биохимии и касается выделения гликозаминогликанов из фиброзного хряща. Задача изобретения - ускорение выделения гликозаминогликанов из фиброзного хряща. Способ заключается в протеолизе измельченного образца папаином, депротеинизации гидролизата трихлоруксусной кислотой и осаждении гликозаминогликанов этанолом, содержащим уксуснокислые соли калия или натрия. Новым в способе является то, что протеолиз осуществляют при постоянном перемешивании пробы в 0,05-0,1 М ацетатном буфере, содержащим папаин в количестве одной пятой от сырого веса ткани при температуре +60±4^oC в течение полутора-двух часов, а депротеинизацию полученного гидролизата и осаждение гликозаминогликанов этанолом проводят в течение полутора-двух часов при температуре /-10/ - /-20/^oC каждый этап. Способ позволяет ускорить процедуру выделения гликозаминогликанов из фиброзного хряща на 2-3 сут.

Изобретение относится к клинической биохимии и касается выделения гликозаминогликанов из фиброзного хряща.

Известен способ выделения гликозаминогликанов из фиброзного хряща, при котором образец ткани подвергают ферментативному протеолизу, из полученного гидролизата выделяют специфические компоненты гликозаминогликаны с помощью осаждения их из гидролизата четвертичными аммонийными основаниями /детергентами/, проводят их поэтапную очистку и количественное определение [1] Известен также способ выделения гликозаминогликанов из тканей, формирующих элементы сустава, в том числе и из фиброзного хряща, заключающийся в ферментативном протеолизе измельченного образца ткани в 0,1 М ацетатном буфере, содержащем папаин в количестве одной четвертой от сырого веса ткани при температуре +60±4^oC в течение 24 ч; депротеинизации полученного гидролизата трихлоруксусной кислотой в течение 24 ч при температуре +4^oC, очистку выделенных гликозаминогликанов с помощью осаждения этанолом, содержащим уксуснокислые соли кальция или натрия в течение 24 ч при температуре +4^oC, количественном определении гликозаминогликанов [2] Недостатком известных способов является большая продолжительность проведения исследований (4-5 суток), что не позволяет оперативно получить информацию о состоянии внутрисуставных соединительнотканых структур.

Задача изобретения ускорение выделения гликозаминогликанов из фиброзного хряща.

Указанная задача достигается тем, что в способе выделения гликозаминогликанов из фиброзного хряща путем протеолиза измельченного образца папаином, депротеинизации гидролизата трихлоруксусной кислотой и осаждения гликозаминогликанов этанолом, содержащим уксуснокислые соли калия или натрия, протеолиз осуществляют при постоянном перемешивании пробы в 0,05-0,1 М ацетатном буфере, содержащем папаин в количестве одной пятой от сырого веса ткани при температуре +60±4^oC в течение полутора-двух часов; а депротеинизацию полученного гидролизата и осаждение гликозаминогликанов этанолом проводят в течение полутора-двух часов при температуре (-10)-(-20)^oC каждый этап.

Проведение протеолиза при постоянном перемешивании пробы позволяет перевести образец в жидкое состояние за более короткий промежуток времени (полутора-два часа вместо суток), кроме того, постоянное перемешивание пробы позволяет снизить количество папаина, необходимое для протеолиза на 5% Меньшее, чем пятая от веса ткани, количество папаина в пробе не позволяет полностью выделить гликозаминогликаны, содержащиеся в фиброзном хряще, а увеличение количества папаина нецелесообразно, так как не дает дополнительного положительного эффекта, а только приводит к дополнительному расходу реактива.

Продолжительность протеолиза менее полутора часов даже при постоянном перемешивании пробы не позволяет полностью перевести ткань в гидролизат, а увеличение времени инкубации более двух часов нецелесообразно, так как за это время происходит полное растворение ткани.

Проведение депротеинизации и осаждения этанолом при температуре (-10)-(-20)^oC позволяет сократить время данных операций до 1,5-2 ч. Меньшая длительность не позволяет полностью провести депротеинизацию и выделение гликозаминогликанов из гидролизата, а большая длительность нецелесообразна, так как не дает дополнительного положительного эффекта, а только удлиняет время проведения этапа.

Способ осуществляют следующим образом.

После взвешивания образца фиброзного хряща, его измельчают до кусочков массой 5-10 мг и проводят ферментативный протеолиз папаином в количестве одной пятой от сырого веса ткани в растворе ацетатного буфера 0,05-0,1 М pH 5,7-5,8 при температуре +60±4^oC в течение полутора-двух часов при постоянном перемешивании пробы с помощью магнитной мешалки или аппарата для встряхивания жидкостей. Депротеинизацию проводят при температуре (-10)-(-20)^oC в течение полутора-двух часов. Осадок отделяют центрифугмрованием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Осаждение гликозаминогликанов из безбелкового центрифугата осуществляют этанолом при температуре (-10)-(-20)^oC в течение полутора-двух часов. Затем проводят количественное определение гликозаминогликанов в полученной пробе.

Пример. Выделение гликозаминогликанов фиброзного хряща /мениска коленного сустава/, удаленного при операции синовкапсулэктомии больной М. 26 лет. Ткань мениска /27 мг/ измельчена до кусочков массой примерно по 5 мг каждый и помещена в бюкс с притертой пробкой. В бюкс добавлен 1 мл 0,1 М раствора ацетатного буфера pH 5,7-5,8, содержащего 200 мг папаина и его активаторы ЭДТА и L-цистеин /по 0,01 М/ на 1000 мл буфера. Протеолиз проведен при температуре +60±4^oC при постоянном перемешивании содержимого бюкса с помощью магнитной мешалки в течение полутора часов. Ткань растворилась полностью. Полученный гидролизат количественно перенесен в пробирку, в которую добавлена трихлоруксусная кислота до конечной концентрации 10% Проба помещена в морозильную камеру при температуре -10^oC на 2 ч. Осадок отделен центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. Осаждение гликозаминогликанов из надосадочной жидкости проведено с помощью добавления к ней 96^o этанола, содержащего уксуснокислый натрий, до конечной концентрации этанола 67^o. Проба тщательно перемешано и оставлена при температуре -10^oC на два часа. Осадок отделен центрифугированием, растворен в воде и гликозаминогликаны повторно осаждены. Для количественного определения гликозаминогликанов в осадке определяли содержание уроновых кислот, добавляя к нему 0,1 мл 0,5 М раствора борной кислоты, 0,2 мл 1 М раствора сульфоминовой кислоты и 2,5 мл концентрированной серной кислоты, тщательно перемешивали, нагревали на кипящей водяной бане, охлаждали, добавляли 0,1 мл 0,2% раствора карбазола в этаноле, пробу тщательно смешивали и повторно нагревали на кипящей водяной бане 10 мин, охлаждали и полученную окраску измеряли на спектрофотометре при длине волны 525 нм. Содержание гликозаминогликанов 0,59 мг/г, что существенно ниже нормального уровня и отражает выраженные воспалительно-деструктивные процессы в ткани мениска.

Предлагаемый способ позволяет ускорить процедуру выделения гликозаминогликанов из фиброзного хряща на двое-трое суток, а также сэкономить дефицитный дорогостоящий реактив папаин.

Источники информации: 1. Adams N.E. Muir H. The glycosaminoglycans of canine menisci /Biochem. J. 1981. V. 197, N 2. P. 385-389.

2. Карякина Е.В. Косягин Д.В. Особенности выделения гликозаминогликанов тканей, формирующих элементы сустава /Всесоюзная конф. ревматологов: Тез. докл. (7-9 декабря 1988 г.). Москва, 1988, с. 108-109 /ПРОТОТИП/.

Формула изобретения

Способ выделения гликозаминогликанов из фиброзного хряща путем протеолиза измельченного образца папаином в 0,1 М ацетатном буферном растворе, депротеинизации гидролизата трихлоруксусной кислотой и осаждения гликозаминогликанов этанолом, содержащим уксусные соли калия или натрия, отличающийся тем, что протеолиз осуществляют при постоянном перемешивании пробы в ацетатном буферном растворе с молярностью не менее 0,05 М, содержащим папаин в количестве одной пятой от сырой массы ткани при 56 64^oС в течение 1,5 2 ч, а депротеинизацию полученного гидролизата и осаждение гликозаминоглакинов этанолом проводят в течение 1,5 -2 ч при температуре (-10) (-20)^oС каждый этап.