Способ регистрации электрической активности нерва в хроническом эксперименте

 

Изобретение относится к экспериментальной физиологии и фармакологии. Сущность изобретения: после выделения нерва для наложения электродов осуществляют перерезку нерва и фиксацию одного из электродов на нерве с помощью лигатуры. Второй электрод фиксируется общепринятым способом. Затем электроды и выделенную часть нерва изолируют силиконовым герметиком. Провода электродов выводят под кожей на спину животного и соединяют с разъемом, который фиксируется к коже.

Изобретение относится к экспериментальной физиологии и фармакологии.

Регистрация электрической активности нерва это широко распространенный прием, который давно применяется для изучения деятельности центральной нервной системы. Первоначально регистрировали активность нерва у наркотизированных и обездвиженных животных. К настоящему времени методика регистрации активности нерва в остром опыте (на наркотизированном и обездвиженном животном) хорошо отработана и не представляет особой трудности для экспериментатора. Благодаря этому внесен большой вклад в развитие представлений о функционировании центральной нервной системы. Однако известно, что наркоз изменяет не только рефлекторные разряды, но характер фоновой импульсации в нервах (Alexander R.S. Tonic and reflex functions of medullery sympathetic cardiovascular centres // J. Neurophysiol. 1946, v.9, p. 205-217; Price H.L. General anaesthesia and circulatory homeostasis // Physiol. Rev.1960, v. 40. p. 187-218). Поэтому в течении последних 30 лет предпринимаются попытки перейти к исследованиям на бодрствующих животных (в хроническом эксперименте), и здесь экспериментаторы сталкиваются с трудностями, которые не решены до настоящего времени.

Главные из них это небольшая длительность стабильной регистрации активности после операции (несколько дней) и артефакты отведения, которые по амплитуде часто превышают полезный сигнал. Имеющиеся в распоряжении экспериментатора дни уходят в основном на выхаживание животного, что приводит к существенному сокращению программы экспериментальных исследований.

Небольшая длительность времени регистрации связана с повреждением нерва, часто ненадежным его контактом с электродами и неудовлетворительной изоляцией электродов и нерва от окружающих тканей. Артефакты отведения вызываются двумя причинами. Во-первых, относительно небольшие перемещения нерва на электродах при различного рода колебаниях электродов из-за деформаций рядом расположенных и в это время работающих органов. Вторая причина это миограмма рядом расположенных поперечно-полосатых мышц, участвующих в изменении позы животного и других двигательных актах. Миограмма регистрируется потому, что отходящие в обе стороны от электродов проксимальный и дистальный участки нерва являются как бы продолжением электродов.

Известен способ регистрации активности нерва в хроническом эксперименте путем выделения участка нервного ствола, подведения под него электродов, размещенных в коробочке из биологически инертного материала, фиксации электродов на нерве путем прошивания тонких металлических электродов через нерв в направлении, перпендикулярном ходу нерва, и изоляции электродов с нервом от окружающих тканей путем накрывания коробочки с электродами пластинкой из того же материала, что и коробочка и фиксации пластинки с помощью миниатюрного винта (А. Д. Ноздрачев. Регистрация токов действия в вегетативных нервных проводниках в условиях хронического эксперимента // Физиол. ж. СССР.1963, т. 49, N. 10, с. 1269-1271). Этот способ позволяет обеспечить хороший контакт электродов с нервом и, хотя нерв значительно травмируется при его прошивании, в редких удачных случаях, по словам автора, удается регистрировать активность довольно продолжительное время. Однако способ не позволяет избавиться от миограммы и применим только на крупных лабораторных животных (кошках и собаках). Кроме того, игла для прошивания нерва неизбежно прерывает ход аксонов в нервном стволе, снижает число волокон, от которых пытались отвести электрическую активность и, таким образом, соотношение сигнал/шум уменьшается еще больше, Известен способ регистрации активности нерва в хроническом эксперименте путем выделения участка нервного ствола, подведения под него электродов, размещенных в коробочке из биологически инертного материала, и изоляции электродов с нервом от окружающих тканей с помощью самотвердеющегося, биологически инертного материала (Kirchner F. Correlations between changes of activity of the renal sympathetic nerve and behavioral events in unrestrained cats // Basic Res. Cardiol. 1974, v. 69. N. 3, p. 243-256). Этот способ позволяет увеличить время регистрации активности нерва, однако при этом трудно обеспечить надежный контакт нерва одновременно с двумя электродами, избавиться от артефактов отведения и использовать этот способ на мелких лабораторных животных (крысах).

Известен способ регистрации активности нерва в хроническом эксперименте, выбранный нами в качестве прототипа, путем выделения участка нервного ствола, подведения под него электродов, которые представляют собой две тонкие проволочки в изоляции за исключением кончиков, и изоляции нерва и электродов самотвердеющимся, биологически инертным материалом (Schad H. Seller H. A method for recording autonomic nerve activity in unanesthetized, freely moving cats // Brain Res.-1975, v. 100, p. 425-430). Фиксация нерва на электродах осуществляется поднятием электродов вместе с нервом над окружающими тканями до натяжения нерва и таким образом плотного его прилегания к электродах. Применение легких электродов и фиксация на нерве путем натяжения нерва до момента затвердевания силиконового компаунда позволили уменьшить артефакты отведения благодаря хорошему контакту электродов и нерва, и увеличить время регистрации активности до 5-6 суток у крупных лабораторных животных. Этот метод успешно применяется при работе и на мелких лабораторных животных (Ricksten S. -E. Thoren P. Reflex inhibition of sympathetic activity during volume load in awake normotensive and hypertensive rats // Acta Physiol. Scand. 1980, v. 110, p. 77-82). Однако у крыс время стабильной регистрации электрической активности нерва не превышает 1,5-2 суток. Это связано с тем, что более тонкие нервы у крыс больше страдают от натяжения. Кроме того, миограмма и другие артефакты отведения оказывали значительное влияние на электрическую активность.

Данное изобретение направлено на снижение артефактов отведения и увеличение времени регистрации активности нерва. Это достигается тем, что после нахождения нерва и выделения его из окружающих тканей, прежде чем подводить электроды под нерв, на него накладывают лигатуру как можно дистальнее и перерезают нерв дистальнее лигатуры. Один электрод фиксируют лигатурой, второй подводят под нерв и только потом поднимают нерв над окружающий тканью. Обеспечив надежный контакт второго электрода с нервом без излишнего его натяжения, электроды и нерв заливают биологически инертным, быстротвердеющим компаундом. Это позволяет свести к минимуму повреждение нерва и при удачной изоляции почти полностью исключить артефакты отведения. В целом это приводит к более длительному периоду регистрации активности нерва с хорошим отношением сигнала к шуму.

Дополнительный эффект заключается в том, что мы имеем возможность регистрировать активность только эфферентных волокон. После перерезки нерва афферентная активность не наслаивается на эфферентную активность, которую мы изучаем, и тем самым нет необходимости в дополнительных усилиях по фильтрации необходимой информации. Этот способ имеет ограничения при регистрации активности от соматических нервов, так как перерезка нерва выключает определенную группу мышц, но может быть использован без ограничений в цели исследования и без каких-либо опасений за состояние животного при регистрации активности симпатической нервной системы. Это связано с тем, что симпатическая активность в настоящие время регистрируется в почечном и нижнем сердечном нервах, которые после выхода из симпатического ганглия идут к иннервируемому ими органу несколькими веточками, иногда больше десяти (А.Д.Ноздрачев. Анатомия кошки. Л. "Наука", 1973, 248 с.). Кроме того, амплитуда регистрируемого сигнала увеличивается, поскольку по сравнению с прототипом мы можем увеличить межэлектродное расстояние при одной и той же длине выделенного участка нерва.

Отведение активности осуществлялось от той части аксонов, которые сохраняли связь с сомой. Поскольку перед перерезкой нерва его перевязывали, то это исключало вытекание аксоплазмы. Кроме того, при повреждении периферических ветвей нервов ретроградные изменения наблюдаются значительно реже, чем при повреждении в непосредственной близости от спинного мозга (А. К. Григорович. Хирургия нервов. Л. "Медицина", 1969, 49-50 с.).

Способ осуществляют следующим образом. У наркотизированного кота в стерильных условиях внебрюшинно обнажают левую почку и ее сосуды С помощью операционного микроскопа находят одну из веточек почечного нерва длиной не менее 10-15 мм и выделяют ее из окружающих тканей. Под нерв подводят лигатуру, смоченную в физиологическом растворе, и перевязывают ею нерв как можно ближе к почке. Нерв дистальнее лигатуры перерезают. Затем с помощью манипулятора к нерву подводят электроды, которые через специальный миниатюрный разъем подключены к усилителю биопотенциалов. Один из электродов той же лигатурой прикрепляется к нерву. Второй электрод подводится под нерв на расстоянии 5-7 мм от первого и оба электрода поднимаются манипулятором над окружающей тканью. С этого момента начинается регистрация электрической активности нерва. Контролируя по осциллографу или с помощью) наушников величину активности и добившись хорошего контакта нерва со вторым электродом, электроды и нерв обволакивают жидким силиконовым герметиком (Sil. Gel 604), который застывает в течении нескольких минут. Отсоединив электроды от усилителя и уложив нерв на прежнее место, соединительные провода выводят на спину животного через подкожный туннель. Разъем электродов закрывают колпачком и фиксируют к коже в месте ее разреза при зашивании раны. Разрез на боку послойно ушивают, обкалывая края раны пенициллином.

Было прооперировано 14 кошек и 19 крыс. У 2 кошек и 5 крыс активность исчезла на следующий день после операции. У 4 кошек и 8 крыс активность сохранялась неизменной на протяжении 4-7 суток, затем значительно снижалась и через 9-13 суток либо прекращалась, либо артефакты отведения "забивали" активность. У 8 кошек активность регистрировалась на протяжении 18-24 суток без существенных изменений. У 6 крыс стабильная регистрация активности сохранялась в течении 12-15 суток.

Формула изобретения

Способ регистрации электрической активности нерва в хроническом эксперименте путем выделения участка нерва из окружающих тканей, подведения под него двух электродов и электрической изоляции электродов и нерва от окружающих тканей, отличающийся тем, что при регистрации активности симпатических нервов один из электродов фиксируют на нерве лигатурой, а нерв дистальнее лигатуры перерезают.