Способ нанесения пробы суспензии для исследования частиц и способ определения размеров и числа частиц в суспензии

 

Использование: в медицине, порошковой металлургии, металлокерамике и т. п. при исследовании микрочастиц, а именно определении их размеров и числа. Сущность изобретения: способ нанесения пробы суспензии для исследования частиц состоит в подготовке пробы и формировании из нее монослоя в виде полосы постоянной ширины на смачиваемой поверхности путем взаимного перемещения с постоянной скоростью заданного объема пробы и указанной поверхности. В процессе подготовки пробы ее разводят в жидкости-консерванте с растворенным в ней полимером, концентрация которого составляет 4-10%, и в процессе формирования получают монослой, фиксированный тонкой полимерной пленкой. Способ определения размеров и числа частиц в суспензии заключается в нанесении заданного объема пробы на смачиваемую поверхность, освещении поверхности с частицами пучком света при ее равномерном перемещении перпендикулярно оптической оси системы и в последующем анализе полученных данных оптоэлектронными методами. При нанесении на поверхность пробы частицы фиксируют полимерной пленкой. Покрытую пленкой поверхность освещают через измерительную диафрагму оптической системы и снимают интегрально-дифференциальные кривые оптического поглощения излучения, прошедшего через покрытые пленкой частицу и область вокруг нее. Горизонтальный размер частицы определяют по длительности выходного сигнала, толщину частицы - по максимальной положительной амплитуде сигнала при входе или выходе частицы из проекции измерительной диафрагмы, одновременно по форме сигнала определяют тип частицы, а число однотипных частиц определяют по количеству однотипных сигналов. 2 з.п. ф-лы, 13 ил.

Изобретения относятся к методам исследования микрочастиц, а именно к определению их размеров и числа, и могут быть использованы в медицине, порошковой металлургии, металлокерамике, производстве абразивов и т.п.

Для визуальных методов исследования микрочастиц по их оптическому изображению чрезвычайно важно качество нанесения пробы на предметное стекло, от которого зависит точность и достоверность определения размеров и числа частиц в заданном объеме пробы.

Известен способ нанесения монослоя на предметное стекло [1] который заключается в пропускании заданного объема суспензии с заданной концентрацией через фильтрующую ленту, находящуюся в движении. Из поступающей на ленту суспензии вакуумным устройством отсасывается излишняя жидкость, затем полученный монослой прижимается к предметному стеклу. Способ сложен в реализации и не гарантирует последовательное размещение частиц вдоль некоторой полосы, что значительно усложняет последующий анализ, так как становится необходимой операция поиска частиц на предметном стекле.

Наиболее близким к предлагаемому способу нанесения пробы суспензии является техническое решение [2] которое заключается в подготовке пробы и формировании монослоя из заданного объема пробы с заданной концентрацией частиц на смачиваемой поверхности предметного стекла путем взаимного перемещения с постоянной скоростью объема пробы и поверхности, при этом монослой суспензии формируют в виде полосы постоянной ширины, определяемой максимальным размером частиц. Такой способ обеспечивает как упрощение процедуры нанесения монослоя, так и последующего автоматического анализа размеров и числа частиц в пробе суспензии.

Подготовка пробы состоит в том, что ее разбавляют до получения заданной концентрации частиц в заданном объеме. Недостатком данного способа является недолговечность препарата, так как после испарения жидкости-разбавителя (что составляет несколько секунд) частицы не удерживаются на поверхности стекла, и препарат становится непригодным для дальнейших исследований. При замедленном испарении жидкости (например, благодаря добавлению в пробу глицерина) за счет поверхностного натяжения происходит не только изменение ширины и толщины нанесенного монослоя, но также хаотическое перемещение частиц внутри монослоя, что затрудняет исследования и автоматизацию процесса анализа.

В основу предлагаемого способа нанесения пробы на предметное стекло положена задача разработки и осуществления фиксирования получаемого монослоя суспензии, исключающего повреждение микрочастиц и обеспечивающего длительную консервацию препарата для последующего автоматического анализа размеров и числа частиц.

Решение этой задачи достигается тем, что при подготовке пробы ее разводят в жидкости-консерванте, содержащей 4-10% растворенного в ней полимера, и в процессе формирования при испарении жидкости получают монослой, фиксированный полимерной пленкой, при этом частицы располагаются неподвижно на поверхности предметного стекла и, благодаря малой толщине пленки, сохраняют свою естественную форму.

На фиг. 1 схематично представлен монослой в разрезе вдоль нанесенной линии на предметном стекле после высыхания жидкости (проба содержит частицы неорганического порошка); на фиг. 2 то же, для монослоя пробы элементов крови; на фиг. 3 фотография пробы элементов крови под полимерной пленкой.

Способ реализован следующим образом.

1. При подготовке пробы суспензии неорганического порошка BaTiO₃ было взято 10 мг порошка и 10 мм³ разбавителя (соотношение 1:100). В качестве разбавителя была использована смесь плазмозаменителей крови типа полидез и гемодез (см. Справочник по переливанию крови и кровезаменителей. М. Медицина, 1982, с.158-170). Концентрация полимера в жидкости составляла 10% Объем пробы 1,5 мм³ был введен в капиллярную трубку с внутренним диаметром 70 мкм. Ожидаемые размеры частиц составляли 0,5-25 мкм. На поверхности предметного стекла 1 данной трубкой были прописаны параллельные линии шириной 70 мкм (± 5 мкм) до истечения всего объема пробы. Общая длина непрерывной линии монослоя составила 15,25 м. Процедура длилась 3 мин 15 с. В процессе нанесения монослоя жидкая составляющая плазмозаменителя испарялась в течение долей секунды, при этом возникала тонкая полимерная пленка 2 по всей ширине и длине линии монослоя. При рассмотрении полученного препарата под микроскопом было обнаружено следующее: частицы 3 порошка расположены цепочкой в один ряд на некотором расстоянии друг от друга, каждая частица закреплена на поверхности стекла 1 посредством пленки 2, облегающей частицу сверху и по контуру. Препарат оставался пригодным для исследований более 150 суток.

2. Особый интерес у исследователей вызывает подготовка препаратов для изучения медико-биологических микрообъектов, например, при клинических анализах крови. Это связано с тем, что клетки крови в растворе очень подвижны, быстро меняют форму и разрушаются.

Предлагаемый способ нанесения пробы для исследования элементов крови был осуществлен так.

Для подготовки пробы суспензии крови была взята кровь объемом 0,1 мм³ и в соотношении 1:100 разбавлена плазмозаменителем типа желатиноль, концентрация полимера в котором составляла 8% Объем пробы полученной суспензии (1,5 мм³) был нанесен на предметное стекло размером 76х26 мм с помощью капиллярной трубки (с внутренним диаметром 30 мкм) в виде множества параллельных линий с шагом 25 мкм. Общая длина непрерывной линии составляла 31,25 м. Процедура длилась не более 5 мин. В результате почти мгновенного испарения жидкой составляющей плазмозаменителя образовалась тонкая пленка 2, закрывающая линию монослоя по всей ее ширине и длине. При наблюдении препарата под микроскопом обнаружено, что пленка 2 покрывает форменные элементы 4,5,6 крови сверху по всему периметру и форма элементов соответствует их естественной форме, что особенно наглядно проявилось для эритроцитов 4, лимфоцитов 5, тромбоцитов 6. Изготовленные по этому способу образцы препаратов сохранялись до 150 суток без каких-либо изменений формы частиц.

На фиг. 3 представлена фотография пробы крови под полимерной пленкой. Поверхность пленки наблюдалась при общем увеличении 350^x при косом освещении. Измерить толщину полученной пленки не представилось возможным. Однако она может быть вычислена без особых затруднений.

Если известен объем пробы W, длина L линии монослоя и его ширина A, а также процентное содержание γ полимера в заданном объеме, то толщина d пленки представляет собой: где S_пл площадь пленки. Для приведенного примера 2 толщина пленки δ_{пл пл}=0,154 мкм.

При концентрации полимера 4% в объеме пробы расчетная толщина пленки составляет 35-50 нм, что сравнимо с толщиной мономолекулярного слоя. Поэтому уменьшение концентрации полимера не имеет смысла, так как оно будет сопровождаться разрывами пленки. Увеличение концентрации полимера более 10% нецелесообразно, так как толщина пленки становится соизмеримой с размерами микрочастиц и будет вносить искажения при последующих измерениях.

Таким образом, экспериментальная проверка подтвердила, что предлагаемыйемый способ нанесения суспензии на предметное стекло обеспечивает изготовление долговечных препаратов, в которых неповрежденные частицы зафиксированы на поверхности предметного стекла, что упрощает задачу последующего автоматического анализа размеров частиц и исключает ошибки при подсчете числа частиц в пробе. Следует особо отметить, что полученные заявляемым способом препараты пригодны для исследования любым из известных способов люминесцентным, интерференционным или поляризационным с помощью известных сканирующих микроскопов (см. Иваницкий Г.Р. и др. Автоматический анализ микрообъектов. М-Л. Энергия, 1967, с.31-40, 79-82).

В настоящее время известно несколько визуальных методов измерения размеров и числа частиц в суспензии, нанесенной на предметное стекло, путем использования оптоэлектронных устройств. К ним относится способ "технического зрения", который заключается в автоматическом анализе изображения препарата с помощью ЭВМ. Этот способ использован в аппаратуре фирмы Opton(DE). Прилагается рекламный проспект 1986 г. (Приложение N1). Недостатком этого способа является длительность обработки информации вследствие использования на некоторых этапах (визуальное распределение частиц по типам) ручного труда оператора и сложность автоматизации при подсчете большого числа частиц. Кроме того, этим способом невозможно измерить параметры неокрашенных прозрачных частиц.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ измерения размеров и числа частиц в жидкости [3] заключающийся в нанесении заданного объема пробы на смачиваемую поверхность предметного стекла, в освещении поверхности с частицами пучком света при ее равномерном перемещении перпендикулярно оптической оси системы и в последующем анализе полученных данных оптоэлектронными методами. Оптическая система проецирует изображение освещенной частицы на линейку элементов фотоприемника поочередно, а сигналы от фотоэлементов подаются на вход линии задержки электронного блока. За счет увеличения времени накопления сигналов от частицы (по числу элементов фотоприемника) обеспечивают повышение чувствительности измерений. Хотя в данном способе исключен ручной труд оператора, но в нем используется довольно сложная оптическая система, требующая тщательной настройки, а измерения размеров и числа частиц производятся в отраженном свете по углу рассеяния света частицей, что не обеспечивает необходимой точности измерений. Известный способ позволяет определить только линейный размер частицы и подсчитать их общее число. Кроме того, данным способом невозможно достоверно измерять параметры прозрачных частиц, а биологические препараты требуют дополнительного окрашивания.

В основу настоящего изобретения положена задача разработки и осуществления способа определения размеров и числа частиц, который обеспечил бы повышение точности измерений, а также позволил бы определять толщину прозрачных и непрозрачных частиц, достоверно распределять их по типам, и производить автоматизированный анализ суспензий.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в способ, который заключается в нанесении заданного объема пробы суспензии на смачиваемую поверхность, в ступенчатом освещении этой поверхности пучком света и в последующем анализе полученных данных оптоэлектронными методами, введены новые операции: при нанесении пробы на поверхность предметного стекла частицы фиксируются полимерной пленкой; покрытую пленкой поверхность с частицами освещают проходящим светом через щель измерительной диафрагмы оптической системы; во время движения поверхности в заданном направлении записывают интегрально-дифференциальные кривые интенсивности оптического поглощения излучения, прошедшего через покрытую полимерной пленкой частицу и область вокруг нее; при анализе полученных кривых определяют горизонтальный размер частицы по длительности выходного сигнала, толщину частицы по максимальной положительной амплитуде сигнала при входе или выходе частицы из проекции измерительной диафрагмы, одновременно по изменению формы сигнала во времени определяют тип частицы, а число однотипных частиц определяют по количеству однотипных сигналов.

На фиг. 4 представлена фотография прозрачных частиц крови под полимерной пленкой; на фиг. 5 ход лучей через плоскую пленку и щель диафрагмы; на фиг. 6 ход лучей через линзу, образованную пленкой, и через щель диафрагмы; на фиг. 7 ход лучей через прозрачную частицу, расположенную под прозрачной пленкой, и через щель диафрагмы; на фиг. 8 структурная схема прибора, с помощью которого осуществлен предлагаемый способ; на фиг. 9 электрический сигнал на выходе оптоэлектронного преобразователя, характеризующий интенсивность оптического поглощения излучения, прошедшего через покрытый пленкой тромбоцит; на фиг. 10 то же, для эритроцита; на фиг. 11 то же, для лимфоцита; на фиг. 12 то же, для нейтрофила; на фиг. 13 а, б, в - электрические сигналы на выходе оптоэлектронного преобразователя, характеризующие интенсивности оптического поглощения излучения для эритроцитов разной формы.

В ходе экспериментальных исследований препаратов, полученных по способу нанесения монослоя суспензии на поверхность предметного стекла с фиксированием частиц тонкой полимерной пленкой, был обнаружен неожиданный оптический эффект: прозрачные клетки крови, находящиеся под пленкой, при прохождении пучка света через них обладали резкой контрастностью по отношению к фону, а вокруг каждой клетки наблюдался светлый ореол (см. фиг. 4). Оптический эффект, названный авторами "линзовым", проявился также и в том, что обнаружились краевые искажения проекции диафрагмы и увеличение амплитуды выходных сигналов по сравнению с фоном.

Объяснение "линзовому эффекту" может быть такое.

Через прозрачное стекло 1, плоскую пленку 2 и измерительную диафрагму 7 пучок лучей проходит беспрепятственно, как показано на фиг. 5. Если на пути лучей расположена линза, образованная пленкой 2 (фиг. 6), то она фокусирует пучок лучей, проходящих через измерительную диафрагму 7. Если же внутри линзы, образованной пленкой 2, расположена прозрачная частица 8 (фиг. 7), то при прохождении через них направленного пучка лучей центральная часть линзы фокусирует лучи, а на границе частицы и наплыва пленки происходит преломление лучей расфокусовка, то сопровождается увеличением контрастности изображения самой частицы. Возникновение светлого ореола может объяснить увеличением светового потока благодаря увеличению толщины пленки в виде наплыва вокруг частицы.

Выявленный "линзовый эффект" позволил реализовать простой и наглядный способ определения размеров и числа частиц в суспензии, нанесенной в виде зафиксированного полимерной пленкой монослоя на поверхности предметного стекла.

Структурная схема прибора, с помощью которого производилась запись интегрально-дифференциальных кривых интенсивности оптического поглощения излучения, представлена на фиг. 8. Прибор включает сканирующий микроскоп с традиционной блок-схемой (см. Иваницкий и др. Автоматический анализ микрообъектов. М-Л. Энергия, 1967, с.31-40). В состав микроскопа входят: источник 9 света (например, галогенная лампа КГМ 9х70), оптическая система 10 концентратор пучка света (например, конденсор ОИ-14), объектив 11 микроскопа, измерительная щелевая диафрагма 7 и сканирующий столик 12, на котором устанавливается предметное стекло 1 с нанесенной на его поверхность пробой суспензии. В состав прибора входит также оптоэлектронный преобразователь 13 в виде фотодиода (типа ФД-263), к которому подключен электронный усилитель (например, микросхема УД 544 2А). Выход преобразователя 13 подключен ко входу аналого-цифрового преобразователя (АЦП) 14, (например, типа ЛА-8 или ЛА-3), см. рекламный проспект Приложение 2 к заявке. К выходу АЦП 14 может быть подключена ПЭВМ (например, типа IBM PC AT 286 (386,486), входы которой согласованы с выходными параметрами АЦП. К выходу преобразователя 13 подключен осциллограф 15 для визуального наблюдения преобразованных сигналов от частиц, через которые проходит пучок световых лучей.

Пример осуществления способа.

На сканирующем столике 12 микроскопа был установлен препарат, подготовленный заранее и представляющий собой предметное стекло 1 с нанесенным на нем монослоем суспензии крови, частицы которой зафиксированы тонкой полимерной пленкой 2 на поверхности стекла 1 по способу, описанному в первой части заявки, пример 2. Пучок света от источника 9 пропущен через оптическую систему 10, предметное стекло 1, объектив 11 и диафрагму 7. Сканирующий столик 12 осуществлял непрерывное продольное и ступенчатое поперечное перемещение стекла 1 перпендикулярно оптической оси системы, обеспечивая последовательное просвечивание монослоя вдоль всей его линии. Продольная скорость перемещения составляла 5 см/с, шаг поперечного смещения при переходе на следующую строку был равен 25 мкм. Пучок света, проходивший через диафрагму, освещал фотодиод преобразователя 13, этот оптический сигнал был преобразован в аналоговый электрический сигнал, который можно было наблюдать на экране осциллографа 15. Электрический сигнал от преобразователя 13, прошедший через АЦП 14 и, преобразованный им в цифровую форму, подавался на вход ПЭВМ, в который производилась запись сигнала на носитель, а для визуального наблюдения сигнал выводился на дисплей.

Анализ записанных кривых основан на следующих предпосылках. В методе оптического сканирования с помощью щелевой измерительной диафрагмы основным определяющим признаком является длительность электрического сигнала на выходе оптоэлектронного преобразователя 13. Этот параметр пропорционален линейному размеру микрообъекта вдоль оси, перпендикулярной проекции измерительной щели на плоскость предметного стекла 1. Однако классификация типа клеток крови только по длительности сигнала не является достоверной из-за большого разброса их размеров, особенно при патологиях. Благодаря "линзовому эффекту" был получен еще один определяющий частицу признак, а именно форма электрического сигнала, записанного при прохождении света через частицу и область вокруг нее. На фиг. 9. 10, 11, 12 представлены характерные электрические сигналы для разных элементов крови: тромбоцита 6, эритроцита 4, лимфоцита 5 и нейтрофила 16. Как видно, сигналы резко отличаются друг от друга. Поэтому по форме сигнала можно идентифицировать типы элементов крови, имея набор типовых сигналов для всех форменных элементов крови.

"Линзовый эффект" позволил выявить еще один информационный признак записанных сигналов при сканировании монослоя: по мере приближения диафрагмы к краю частицы (вхождение в линзу) резко увеличивалась амплитуда выходного сигнала по отношению к уровню сигнала фона. Такая же картина наблюдалась при выходе из линзы (см. фиг. 8-13). Предположение, что амплитуда приращения сигнала ΔU зависит от вертикального размера (толщины) частицы, полностью подтвердилось при контрольных измерениях частиц (пыльцы растений) с заранее известным диаметром: была обнаружена линейная зависимость приращения сигнала ΔU от диаметра частиц, а именно от ее толщины. Кроме того, оценка толщины частиц по амплитуде выбросов сигнала на входе в линзу и на выходе из линзы дала значения, совпадающие с данными, известными из медицинских источников (например, эритроциты диаметром 6,8 7,2 мкм имеют толщину 1,5 2 мкм, см. Лабораторные исследования в клинике. Справочник под ред. Мельникова В.В. М. Медицина, 1987, с.80-89).

По снятым кривым (фиг. 8-12) были определены размеры частиц. Пример определения размеров частицы. Для эритроцита записан сигнал V(t) на фиг. 10. V_o= 10 B уровень фона. Скорость сканирования V=5 см/с. Диаметр частицы (см) d= τ ·V, где t длительность импульса (между точками прохождения его через ноль относительно уровня V₀).

Длительность импульса: 135 ≅ τ_эр ≅ 150 мкс. Диаметр эритроцита: 6,65 ≅ d_эр ≅ 7,5 мкм.

Приращение сигнала ΔU на входе и выходе из линзы составило 76-84 мВ. По калибровочной характеристике, снятой для частиц с известными размерами, определено, что приращение ΔU 40 мВ соответствует толщине 1 мкм. Отсюда определены толщины эритроцитов: 1,8 ≅ h_эр ≅ 2,1 мкм.

Для частиц крови, имеющих одно или несколько ядер (лейкоциты), по записанному сигналу можно определить размеры ядер, так как при прохождении лучей света через ядро клетки электрический сигнал имеет импульс, превышающий уровень V_o, а его длительность τ_я соответствует диаметру ядра d_я. Для лимфоцита 5, имеющего одно ядро, приведена кривая на фиг. 11. Для нейтрофила 16, содержащего несколько ядер, сигнал имеет несколько максимумов (фиг. 12).

Еще одна особенность способа, имеющая безусловное значение при медицинских исследованиях, состоит в том, что форма сигнала позволит оценить качественное состояние клетки крови. На фиг. 13 приведены кривые для эритроцитов, имеющие разную форму. На фиг. 13,а представлен сигнал для нормального эритроцита 4. Если форма эритроцита приближается к сферической (сферуляция эритроцита), как на фиг. 13,б, кривая практически имеет один минимум и амплитуда сигнала увеличена по сравнению с нормальной клеткой. Для уплощенного эритроцита (фиг. 13, в) экстремум двугорбой кривой приближается к уровню фона, а амплитуда выброса сигнала значительно меньше, чем для нормальной клетки. Другими словами, по форме сигнала и амплитуде выброса сигнала можно определить патологию клеток. Это позволяет производить диагностику заболевания по анализу изменений формы записанных сигналов.

Таким образом, кривые интенсивности оптического поглощения излучения, прошедшего через покрытые полимерной пленкой частицы и области вокруг них, позволяют определить горизонтальный размер частиц по длительности сигнала, толщину частиц по амплитуде выброса сигнала при входе или выходе частицы из проекции измерительной диафрагмы, тип частицы по форме сигнала, число однотипных частиц по количеству однотипных сигналов.

По сравнению с известным способом-прототипом предлагаемый способ обеспечивает повышение точности измерений размеров и числа частиц, достоверное распределение частиц по типам, а также измерение толщины частиц. Кроме того, дополнительное преимущество заявляемого способа состоит в том, что благодаря "линзовому эффекту" увеличивается контрастность прозрачных частиц по отношению к фону, что улучшает возможность их визуального наблюдения и повышает разрешающую способность аппаратуры при записи кривых поглощения излучения.

Формула изобретения

1. Способ нанесения пробы суспензии для исследования частиц, заключающийся в подготовке пробы и формировании из нее монослоя в виде полосы постоянной ширины на смачиваемой поверхности путем взаимного перемещения с постоянной скоростью заданного объема пробы и поверхности, отличающийся тем, что в процессе подготовки пробы ее разводят в жидкости-консерванте с растворенным в ней полимером, концентрация которого в объеме пробы составляет 4 10% и в процессе формирования получают монослой, фиксированный тонкой полимерной пленкой.

2. Способ определения размеров и числа частиц в суспензии, заключающийся в нанесении заданного объема пробы на смачиваемую поверхность, освещении поверхности с частицами пучком света при ее равномерном перемещении перпендикулярно оптической оси системы и последующем анализе полученных данных оптоэлектронными методами, отличающийся тем, что при нанесении на поверхность объема пробы частицы фиксируют полимерной пленкой, покрытую пленкой поверхность с частицами освещают проходящим светом через измерительную диафрагму оптической системы и во время движения поверхности в заданном направлении снимают интегрально-дифференциальные кривые интенсивности оптического поглощения излучения, прошедшего через покрытые пленкой частицу и область вокруг нее, затем полученные кривые подвергают анализу, при этом горизонтальный размер частицы определяют по длительности выходного сигнала, толщину частицы по максимальной положительной амплитуде сигнала при входе или выходе частицы из проекции измерительной диафрагмы, одновременно по изменению формы сигнала во времени определяет тип частицы, а число однотипных частиц определяют по количеству однотипных сигналов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14