Вакцина ротавирусная инактивированная для иммунизации животных

 

Использование: вирусология, иммунология, животноводство. Сущность изобретения: ротавирусная инактивированная вакцина содержит штамм ротавируса обезьян SA-11 и производное платины (II) с полианионом ДНК в концентрации (5,3-81)·10^-3 (в пересчете на платину). Вакцина обладает высокой иммуногенностью против ротавирусного гастроэнтерита, безопасна и стабильна. 3 табл.

Изобретение относится к области вирусологии, в частности к получению инактивированных вакцин для иммунизации животных, и может быть использовано для специфической профилактики ротавирусного гастроэнтерита.

Известна инактивированная ротавирусная вакцина для пассивной иммунизации телят против ротавирусного гастроэнтерита (Gastrucei G. Fregeri F. Ferrari M. //Comp. Immunol. Microbiol. and Infect. Disiases. 1989, vol. 12, N 3, p. 71-76) [1] Вакцина состоит из ротавируса крупного рогатого скота с биологической активностью 3·10⁸ ЦПД 50/мл и содержит формалин в качестве инактиватора в конечной концентрации от 0,05 до 0,10% и бисульфат натрия.

Перед введением вакцины животным (коровам) в нее добавляют адъювант - водно-масляную эмульсию, что повышает ее иммуногенность.

Как следует из технической сущности, известная техническая вакцина является токсичной, т. к. практически нельзя достичь полной инактивации формалина, который является токсичным для микроорганизмов (Методы лабораторных исследований по бешенству. ч.V. Методы определения безвредности и иммуногенности вакцин/ Под редакцией Martin M. Kaplan, H. Lary Koprorosky. ВОЗ. М. Медицина, 1975, 358 с.) [2] обладает низкой иммуногенностью, что обусловлено необходимостью введения в нее адъюванта, действие которого направлено на повышение иммуногенности (Справочник по применению бактерийных и вирусных препаратов/ Под ред. Дзагурова С.Г. Резепова Ф.Ф. М. Медицина, 1975, 223 с.) [3] и характеризуется нестабильностью при хранении, т.к. известно (Петров Р. В. Хаитов Р.М. Искусственные антигены. М. Медицина, 1988, 288 с.) [4] что стабильность ротавирусных вакцин не превышает 24 месяца.

Наиболее близкой к изобретению по технической сущности и достигаемому эффекту является ротавирусная вакцина, содержащая ротавирус обезьян SA-11, инактивированный формалином (WO 94/01134, кл. A 61 K 39/42, 1994) [5] Для вакцины [5] присущи те же недостатки, что и для вакцины [1] токсичность, низкая иммуногенность, нестабильность при хранении. Подтверждением указанных свойств вакцины [5] служат данные, полученные при исследовании ротавирусной вакцины с использованием вирусного материала, полученного нами из штамма ротавируса обезьян SA-11 с антигенной активностью 1 1024 в РНГА (реакция непрямой гемагглютинации) ГАЕ/0,25 мл и биологической активностью 10^5,5 ЦПД 50/мл. Вакцину готовят путем добавления к вирусному материалу формалина до конечной концентрации 0,1% и последующей инактивации вируса в течение 72 ч при 37^oC. Полученную формалинизированную вакцину испытывают на иммуногенность у кролей и стабильность ротавирусных антигенов при хранении. Результаты приведены в табл.1, где отражены основные свойства вакцины.

Как следует из данных табл.1, ротавирусная вакцина, полученная из вируса с высокой антигенной активностью, обладает низкой иммуногенностью против ротавирусного гастроэнтерита, выраженной титром антиротавирусных антител в РТНГА (реакции торможения непрямой гемагглютинации), равном 1 640; характеризуется невысокой стабильностью, составляющей всего 24 месяца и является токсичной.

К недостаткам получения известной вакцины следует отнести довольно большую продолжительность ее получения, обусловленную медленным протеканием инактивации вируса формалином.

В основу изобретения поставлена задача разработать состав ротавирусной инактивированной вакцины для иммунизации животных, состоящий из штамма ротавируса обезьян SA-11 и производного платины (II) с полианионом дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), что позволяет получить вакцину нетоксичную, характеризующуюся высокой иммуногенностью против ротавирусного гастроэнтерита и стабильностью при минимальных затратах времени ее получения.

Для решения поставленной задачи предложена вакцина ротавирусная инактивированная для иммунизации животных, содержащая вакцинный штамм ротавируса обезьян SA-11 и производные платины (II) с полианионом дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) общей формулы [1] [PtCl(NH₃)]₆(OH)_x(H₂O)_y}_n-ДНК^-m, где ДНК^-m=-(C₃₉H_55-rO₃₂N₁₅P₄)-_n^-m; n=2000±200; при x=0, y=12, m=6n, r=6; x=2, y=10, m=4n, r=4; x=0, y=6, m=6n, r=6; при следующем соотношении компонентов, в мас.

Производные платины (II) с полианионом ДНК общей формулы [1] (в пересчете на платину) (5,3 81)·10^-3 Вакцинный штамм ротавируса обезьян SA-11 с антигенной активностью (1-64)-(1-1024) в РНГА ГАЕ/0,25 мл и биологической активностью 1·10^5,5-1·10^7,5 ЦПД 50/мл Остальное Отличием предложенной вакцины является наличие в ее составе производных платины (II) с полианионом ДНК в качестве инактивирующего средства.

Нами показано, что система, состоящая из вакцинного штамма ротавируса обезьян SA-11 и заявляемых производных платины (II) с полианионом ДНК, обеспечивает формирование иммуностимулирующего комплекса "ротавирусные протективные антигены производные платины (II) с полианионом ДНК". Как мы полагаем, комплекс обеспечивает эффективную инактивацию вируса, усиливает иммуногенность и повышает стабильность вакцины при значительном сокращении времени получения нетоксичной инактивированной вакцины.

Производные платины (II) с полианионом ДНК известны (Патент ЕР N 0374267, кл. A 61 K 35/28, 31/555, 1990) [6] Данные соединения синтезированы для применения в качестве действующего вещества лекарственного препарата противоопухолевого действия. Соединения платины не обладают иммунодепрессивным действием и не являются токсичными в концентрациях, используемых для приготовления вакцины (полулетальная доза ЛД₅₀ равна 102 мг/кг тела) [6] в то время как на одну иммунизацию животного расходуется максимально 144 мг.

Таким образом, на основании присущих данным соединениям платины свойств не следует явным образом, что их введение в состав вакцины придаст ей высокую иммуногенность и стабильность.

Согласно изобретению полученная вакцина является нетоксичной, обладает высокой иммуногенностью, характеризуемой титрами антител в РТНГА на уровне 1 16400, повышенной стабильностью, характеризуемой постоянством величин титров антиротавирусных антител в РТНГА в течение не менее 40 месяцев при стандартных условиях хранения.

Вакцину готовят следующим образом. Культуру клеток, например Vero, инфицируют ротавирусом обезьян группы А с антигенной активностью (1 64) (1 1024) РНГА ГАЕ/0,25 мл и биологической активностью 1·10^5,5-1·10^7,5 ЦПД 50/мл, активированным трипсином. Инфицированные клетки инкубируют при 37^oC в течение 48 ч, а затем разрушают инфицированные клетки трехкратным заморожением и оттаиванием для увеличения выхода вируса. Затем вирусный материал осветляют при низкоскоростном центрифугировании и вводят во взаимодействие с производным платины (II) с полианионом ДНК, термостатируют при 37^oC не менее 90 мин для инактивации вируса.

В качестве производных платины (II) с полианионом ДНК общей формулы [1] [PtCl(NH₃)]₆(OH)_x(H₂O)_y}_n-ДНК^-m,
где ДНК^-m= -(C₃₉H_55-rO₃₂N₁₅P₄)-_n^-m;
n=2000±200
используют следующие соединения:
соединение I при x=0, у=12, m=6n, r=6;
поли{гексакис[хлорамминдиакваплатина (II)]-μ-дезоксирибонуклеат формулы
[PtCl(NH₃)]₆(H₂O)₁₂}_n-ДНК^-m,
где n=1900±90; m=6n;
ДНК^-m= -(C₃₉H₄₉O₃₂N₁₅P₄)-_n^-m;
соединение II при х=2, у=10, m=4n, r=4;
поли{бис[гидроксохлороамминакваплатина (II)]- тетракис[хлороамминдиакваплатина (II)]-m-дезоксирибонуклеат формулы [PtCl(NH₃)]₆(OH)₂(H₂O)₁₀}_n-ДНК^-m,
где где n=2000±100; m=4n;
ДНК^-m= -(C₃₉H₅₁O₃₂N₁₅P₄)-_n^-m;
соединение III при х=0, у=6, m=6n, r=6;
поли{гексакис[хлороамминакваплатина (II)]-m -дезоксирибонуклеат формулы [PtCl(NH₃)]₆(H₂O)₆}_n-ДНК^-m,
где n=2100±100; m=6n;
ДНК^-m= -(C₃₉H₄₉O₃₂N₁₅P₄)-_n^-m.

Соединения I, II, III представляют собой мелкокристаллические порошки желтого цвета, без запаха, устойчивые на воздухе, способные в течение года храниться без изменения свойств.

Полученный конечный продукт представляет собой инактивированную ротавирусную вакцину для иммунизации сельскохозяйственных животных против ротавирусного гастроэнтерита и имеет следующий ингредиентый состав, в мас.

Производные платины (II) с полианионом ДНК общей формулы [1] (в пересчете на платину) (5,3 81)·10^-3
Вакцинный штамм ротавируса обезьян SA-11 с антигенной активностью (1 64)-(1 1024) в РНГА ГАЕ/0,25 мл и биологической активностью 1·10^5,5-1·10^7,5 ЦПД 50/мл Остальное
Серии полученной ротавирусной вакцины испытывают на иммуногенность, токсичность, стерильность, безопасность и стабильность.

Иммуногенность вакцины специфическую активность исследуют в лабораторных тестах с эритроцитарным ротавирусным диагностикумом фирмы "Ростэпидкомплекс" в реакции торможения непрямой гемагглютинации и выражают титрами антиротавирусных антител в РТНГА (Зарубинский В.Я. Колпаков С.А. Применение реакции непрямой гемагглютинации для диагностики ротавирусного гастроэнтерита// Вопр. вирусологии, 1989, N 2, с.250-253) [7]
Стабильность вакцины характеризуется временем, в течение которого сохраняется постоянным величина титра антиротавирусных антител в РТНГА.

Токсичность вакцины определяется стандартным методом и оценивается по цитологически дозам ЦТД 50/мл [2]
Безопасность вакцины характеризуется отсутствием инфекционной активности в культуре клеток и определяется по ЦТД 50/мл [2]
Стерильность вакцины характеризуется отсутствием роста м/о при посеве на сахарный бульон, МПА, среду Сабуро (Общие требования, предъявляемые к стерильности биологических препаратов// Требования к биологическим препаратам. N6 Wld.Hlth Org. techn. Rep. Ser. 1972, N 486) [8]
Пример выполнения по изобретению. Взвесь культуры клеток Vero в ростовой питательной среде, состоящей из основной среды Игла с 10% эмбриональной телячьей сыворотки, в посевной концентрации 300 тысяч клеток на мл вносят в сосуды для культивирования и выращивают в стационарных условиях до образования в них монослоев. Затем культуральную среду из сосудов удаляют и вносят на монослой посевной ротавирус обезьян штамма SA- 11, активированный трипсином, в конечной концентрации 10 мкг на 1 мл вирусной суспензии, с антигенной активностью 1024 в РНГА ГАЕ/0,25мл и биологической (инфекционной) активностью 10^5,5 ЦПД 50/мл. Адсорбцию вируса проводят в течение 2 ч при температуре 37^oC. Затем неадсорбировавшийся вирус удаляют, а монослои клеток дважды отмывают любым сбалансированным солевым раствором, например раствором Хенкса. После чего в сосуды добавляют среду для размножения вируса, состоящую из стандартной основной среды Игла и трипсина (конечная концентрация трипсина в среде 1 мкг/мл). Инфицированные культуры инкубируют при 37^oC в течение 48 ч. После окончания инкубирования остатки клеточного монослоя вместе с вирусосодержащей жидкостью подвергают трехкратному замораживанию и оттаиванию, собирают вирусосодержащий материал и освобождают его от обломков клеток центрифугированием при 1000 g в течение 20 мин.

Затем к 100 мл осветленной вирусной суспензии добавляют 10 мл раствора поли{гексакис[хлороамминакваплатины (II)]-m- дезоксирибонуклеата (соединение III) в конечной концентрации 0,2136 мг/л (в пересчете на платину) и инкубируют при 37^oC в течение 90 мин.

Полученный продукт представляет собой инактивированную ротавирусную вакцину при следующем соотношении компонентов, в мас.

Производное платины (II) с полианионом ДНК (в пересчете на платину) (соединение III) 21·10^-3
Вакцинный штамм ротавируса обезьян SA-11 с антигенной активностью 1024 в РНГА ГАЕ/0,25 мл и биологической активностью 1·10^5,5 ЦПД 50/мл - Остальное
Вакцина нетоксична, безопасна, стерильна, обладает иммуногенностью 1 16400 РТНГА у кролей, стабильна в течение 40 месяцев (табл.2, пример 5).

В табл.2 отражены составы вакцин, полученные с использованием ротавируса обезьяны SA-11, обладающего различной антигенной активностью, и содержащие производные платины (II) с полианионом ДНК, количество которых находится как в заявляемом диапазоне, так и за его пределами.

Установлено, что количественный и качественный состав вакцины выбран из условий, обеспечивающих полную инактивацию ротавируса обезьян SA-11, иммуногенность у кролей и стабильность вакцины при минимальном времени инактивации вируса (табл.2, примеры 1-19).

Оптимальным с точки зрения достижения технического результата является содержание в вакцине производных платины (II) с полианионом ДНК в диапазоне (5,3 81)·10^-3 мас. (в пересчете на платину).

Содержание в вакцине производных платины (II) с полианионом ДНК ниже заявляемого предела, даже при использовании ротавируса обезьян SA-11 с высокой антигенной активностью, не обеспечивает вакцине стерильность, безопасность и высокую иммуногенность против ротавирусного гастроэнтерита: титр антиротавирусных антител в РТНГА составляет всего 1 640, что находится на уровне, достигаемом известной вакциной (табл.2, пример 21).

Верхний предел содержания в вакцине производных платины (II) с полианионом ДНК ограничен тем, что дальнейшее увеличение не способствует улучшению качества вакцины и является нецелесообразным (табл.2, пример 22).

Оптимальным значением антигенной активности ротавируса SA-11, обеспечивающим высокую эффективность вакцины в заявляемом диапазоне содержания производных платины (II) с полианионом ДНК, является (1 64) (1 1024) в РНГА ГАЕ/0,25 мл.

Использование ротавируса с антигенной активностью ниже заявляемого предела при максимальном содержании соединения III (платины) приводит к получению вакцины с низкой иммуногенностью: титр антивирусных антител составляет 1 1280, что практически соответствует иммуногенности известной вакцины (табл. 2, пример 20).

Верхний предел величины антигенной активности ротавируса обезьян SA-11 ограничен биологическими свойствами системы "вирус клетка". Экспериментально установлено, что в течение 1,5 ч достигается полная инактивация ротавируса обезьян SA-11 в присутствии производного платины (II) с полианионом ДНК в заявляемом диапазоне его содержания, что обеспечивает получение инактивированной вакцины.

Уменьшение времени инактивации ротавируса приводит к получению вакцины, которая является опасной, т.к. содержит неинактивированный вирусный материал (табл.2, пример 24).

Уменьшение времени инактивации ротавируса не сказывается на повышении качества вакцины и является нецелесообразным (табл.2, пример 23).

Данные табл.3 подтверждают высокую иммуногенность предложенной ротавирусной вакцины при вакцинации различных видов животных.

Преимущества предложенной ротавирусной инактивированной вакцины для иммунизации животных по сравнению с известной ротавирусной вакциной подтверждаются данными, представленными в табл.1 и 2.

Как следует из сопоставительного анализа качества и эффективности вакцин, предложенная вакцина превосходит известную по следующим показателям:
по иммуногенности против ротавирусного гастроэнтерита в 6 25 раз, что выражается в увеличении титров антиротавирусных антител в 6 25 раз, например, у кролей;
по стабильности приблизительно в 2 раза, что выражается в увеличении времени постоянства титров антиротавирусных антител приблизительно в 2 раза;
является нетоксичной.

Предложенная вакцина, как и известная, является стерильной и безопасной.

Кроме того, для получения предложенной вакцины требуется в 48 раз меньшие затраты времени за счет более быстрой и эффективной инактивации вируса.

Следует подчеркнуть, что разработанная вакцина ротавирусная инактивированная соответствует основным направлениям создания современных вакцинных препаратов, состоящим в совершенствовании их композиций путем использования в составе иммуностимулирующих комплексов (ИСКОМов).

Формула изобретения

Вакцина ротавирусная инактивированная для иммунизации животных, включающая вакцинный штамм ротавируса обезьян Sa II и инактивирующее средство, отличающаяся тем, что в качестве инактивирующего средства используют производные платины (II) с полианионом дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) общей формулы I [PtCl(NH₃)]₆(OH)_x(H₂O)_y}_n - ДНК^-m,
где ДНК^-m (C₃₉H₅₅ - rO₃₂N₁₅P₄)_n^-m;
n 2000 ± 200,
при x 0, y 12, m 6n, r 6;
x 2, y 10, m 4n, r 4;
x 0, y 6, m 6n, r 6,
при следующем соотношении компонентов, мас.

Производные платины (II) с полианионом ДНК общей формулы I (в пересчете на платину) (5,3 81) · 10^-3
Вакцинный штамм ротавируса обезьян SА II с антигенной активностью (1 - 64) (1 1024) в РНГА ГАЕ / 0,25 мл и биологической активностью 1 · 10^5,5 1 · 10^7,5 ЦПД 50/мл - Остальноет

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4