Способ получения пептида - сна

 

Изобретение касается усовершенствованного способа получения пептида δ- сна TrpAlaGlyGlyAspAlaSerGlyGlu (I), обладающего широким спектром физиологической активности. Способ включает конденсацию пентафторфенилового эфира Boc-защищенного тетрапептида BocTrpAlaGlyGlyOPfp (II) с пентапептидом AspAlaSerGlyGlu (III), в диметилформамиде в присутствии N-метилформолина, удаление Boc-группы муравьиной кислотой при температуре (-2) - (+8)^oC и хроматографическую очистку целевого продукта. Гомогенный по данным ТСХ пептид δ- сна получают с выходом 70 - 80%. 2 табл., 1 ил.

Изобретение относится к области природных физиологически активных пептидов, конкретно, к усовершенствованному способу получения пептида δ-сна формулы I: TrpAlaGlyGlyAspAlaSerGlyGlu Пептид δ-сна обладает антистрессорной [1], противоалкогольной [2], антиметастатической [3] и другими видами биологической активности.

В основе известных способов получения пептида δ-сна лежит конденсация N_α-защищенного тетрапептида TrpAlaGlyGly с пентапептидом последовательности AspAlaSerGlyGlu. Известен способ [4], согласно которому пептид δ-сна получают конденсацией N_αZ-защищенного тетрапептида, активированного по C-концу методом смешанных ангидридов с изобутилхлорформиатом, с защищенным (бензильными группировками) пентапептидом структуры Asp(OBzl)AlaSer(Bzl)GlyGlu(OBzl)₂ с последующим гидрированием полученного защищенного нонапептида над Pd-чернью для снятия защитных групп и очисткой целевого продукта на ДЕАЕ-сефадексе. Использование процесса гидрирования для снятия защитных групп приводит к частичному гидрированию индольного кольца триптофана и получению ряда других трудноотделимых примесей [5, 6]. Кроме того, процесс гидрирования в данном случае плохо воспроизводим и трудно доходит до конца из-за осаждения на катализаторе из раствора продуктов неполного гидрирования. Выход пептида δ-сна не превышает 56%.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ получения пептида δ-сна, включающий конденсацию п-нитрофенилового эфира N_αZ-защищенного тетрапептида с незащищенным пентапептидом в водно-диоксановой среде, снятие защитной Z-группы гидрированием над Pd-чернью и очистку целевого пептида ионообменной хроматографией [7]. Использование процесса гидрирования для снятия защитных групп, также как и в предыдущем способе, приводит к частичному гидрированию индольного кольца триптофана и получению ряда других трудноотделимых примесей [5 и 6]. Способ позволяет получать пептид δ-сна с выходом 52%.

Предлагаемый усовершенствованный способ получения пептида δ-сна основан на конденсации пентафторфенилового эфира Boc-защищенного тетрапептида формулы II: BocTrpAlaGlyGlyOPfp с пентапептидом формулы III: AspAlaSerGlyGlu в диметилформамиде в присутствии N-метилморфолина с последующим удалением Boc-группы с помощью муравьиной кислоты при температуре (-2) - (+8)^oC и хроматографической очисткой целевого продукта.

Отличия предлагаемого способа от известного [7] заключаются в том, что исходный тетрапептид используется в виде пентафторфенилового эфира и имеет Boc-защиту по N-концу, а конденсацию осуществляют в присутствии N-метилморфолина в диметилформамиде (ДМФА). Кроме того, для снятия защитной группы не используется процесс гидрирования: Boc-группу отщепляют с помощью муравьиной кислоты при температуре (-2) - (+8)^oC.

Использование вышеизложенных отличий в предлагаемом способе позволяет предотвратить целый ряд побочных процессов, что дает возможностью получать пептид δ-сна с выходом не менее 70%.

Преимуществом предлагаемого способа является отсутствие процесса гидрирования для снятия защитных групп на заключительной стадии, т.к. использование последнего может приводить к частичному гидрированию индольного кольца триптофана и получению ряда других трудноотделимых примесей [5 и 6]. В отличие от известных в предлагаемом способе удаление защитной группы осуществляется в более мягких, легко контролируемых и воспроизводимых условиях.

Преимущества предлагаемому способу сообщает также и то, что исходный пентапептид вводится в синтез в виде N-метилморфолиновой соли (которая образуется после того как в раствор пентапептида в диметилформамиде добавляется N-метилморфолин). Существенное значение для синтеза имеет то, что N-метилморфолиновая соль пентапептида хорошо растворяется в диметилформамиде. Это обеспечивает высокий выход при образовании пептидной связи. В то же время известно, что соли карбоновых кислот с органическими аминами (циклогексиламином, дициклогексиламином, N-метилморфолином и др.) обладают пониженной растворимостью в органических растворителях, в том числе и в ДМФА.

Известно, что при использовании в синтезе пептидов со свободными карбоксильными группами (в нашем случае - пентапептид) могут протекать процессы переэтерификации [8] или образования смешанных ангидридов, приводящие к образованию пептидов незаданной структуры. Однако, в описываемом способе вышеуказанные реакции не протекают. Кроме того, к существенному снижению выхода целевого продукта и получению сложной смеси пептидов может приводить О-ацилирование гидроксильной группы серина пентафторфениловым эфиром [11]. Однако, условия конденсации, структура исходных пептидов и их хорошая растворимость обеспечивают отсутствие О-ацилирования.

Кроме того, известно, что при наличии в структуре пептида последовательности AspAla могут протекать реакции транспептидации и образования имида [9] . А наличие свободной карбоксильной группы может приводить к переэтерификации по β-карбоксильной группе аспарагиновой кислоты [10]. Однако, в предлагаемых условиях синтеза вышеупомянутые побочные процессы идут крайне незначительно, что подтверждается данными ТСХ и высоким выходом конечного продукта.

Также неочевидным является использование Boc-группы для защиты остатка триптофана. Известно, что при деблокировании Boc-защищенных пептидов могут получаться трудноотделимые продукты трет-бутилирования триптофана [6 и 8]. В предлагаемом способе благодаря структуре промежуточного пептида и подобранным условиям деблокирования удается избежать побочного процесса трет-бутилирования.

Необходимо также отметить, что при синтезе триптофансодержащих пептидов остаток триптофана часто защищают по индольному азоту для предотвращения протекания побочных реакций с участием гетероцикла [9]. В предлагаемом способе используется пентафторфениловый эфир триптофансодержащего тетрапептида, при этом при его получении и использовании не требуется защита индольного атома азота.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом (чертеж). Сначала получают тетрапептид и пентапептид методом ступенчатого наращивания пептидной цепи, с использованием активированных эфиров аналогично [4]. Пентафторфениловый эфир Boc-защищенного тетрапептида (II) получают реакцией с дипентафторфенилкарбонатом в ДМФА в присутствии N-метилморфолина. Пентапептид (III), получают гидрированием над Pd-чернью защищенного пентапептида BocAsp(OBzl)AlaSer(Bzl)GlyGlu(OBzl)₂ в присутствии уксусной кислоты. Структура пентапептида III подтверждена данными масс- и ЯМР-спектроскопии.

Пентапептид III растворяют в ДМФА, добавляют N-метилморфолин и образовавшуюся N-метилморфолиновую соль пентапептида конденсируют с пентафторфениловым эфиром Boc-защищенного тетрапептида в течение 16-47 ч, после чего растворитель упаривают. Полученный защищенный нонапептид деблокируют в муравьиной кислоте. Очистку пептида δ -сна проводят хроматографией на ДЕАЕ-сефадексе.

Для ТСХ используют пластинки с силикагелем фирмы Merck N 5724 и хроматографические системы, указанные в табл. 1.

Обнаружение веществ проводят путем последовательной обработки пластинок хлором, а затем 2%-ным водным раствором крахмала, содержащим 1% NaI и 0,1% NaN₃. Упаривание растворов проводят на роторном испарителе при 30-40^oC.

В табл. 2 приведены физико-химические характеристики целевого продукта и промежуточных пептидов, т.к. промежуточные соединения являются новыми.

Пример 1. BocTrpAlaGlyGly (IV). 14,2 г (0,05 моль) HBr·AlaGlyGly растворяют в 140 мл воды, добавляют 4,2 (0,05 моль) NaHCO₃, а затем - 28,2 г (0,06 моль) BocTrpOPfp в 200 мл ДМФА. Смесь перемешивают в течение 12 ч. Растворители упаривают досуха, полученное масло растворяют в 100 мл этилацетата, промывают 2x100 мл 10% раствора лимонной кислоты, затем - 2x100 мл 10% раствора NaCl, этилацетатный слой высушивают над Na₂SO₄ и упаривают. Получают 22,8 г (93%) пептида IV.

Пример 2. BocTrpAlaGlyGlyOPfp (II). К 20 г (0,041 моль) пептида IV в 100 мл ДМФА добавляют 17,7 г (0,045 моль) дипентафторфенилкарбоната и 4,5 мл (0,041 моль) N-метилморфолина. Смесь перемешивают 12 ч, упаривают досуха и перекристаллизовывают из этилацетата. Получают 26,4 г (98%) пептида II.

Пример 3. CF₃COOH·AspAlaSerGlyGlu. 46,9 г (0,05 моль) пентапептида BocAsp(OBzl)AlaSer(Bzl)GlyGlu(OBzl)₂ растворяют в 1 л 85%-ной уксусной кислоты, добавляют 5 г Pd-черни и гидрируют 80 ч. По завершении гидрирования катализатор отфильтровывают, к фильтрату добавляют 50 мл трифторуксусной кислоты, выдерживают 30 мин при комнатной температуре и упаривают досуха. Полученное масло обрабатывают этилацетатом и получают 26,5 г (98%) трифторацетата пентапептида III.

Пример 4. BocTrpAlaGlyGlyAspAlaSerGlyGlu (V). 2,37 г (3,6 ммоль) пептида II растворяют в 40 мл абс. ДМФА, добавляют 1,66 г (3 ммоль) пентапептида III и 1,32 мл (12 ммоль) N-метилморфолина в 50 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивают 18 ч, упаривают досуха и полученное масло обрабатывают 100 мл смеси этилацетат : уксусная кислота 10 : 1. Образовавшийся осадок отфильтровывают, промывают на фильтре 100 мл этилацетата, затем - 50 мл диэтилового эфира и высушивают в вакууме. Получают 3,69 (95%) нонапептида V, гомогенного по ТСХ.

Пример 5. TrpAlaGlyGlyAspAlaSerGlyGlu (I). К 2,59 г (2 ммоль) пептида V добавляют 40 мл муравьиной кислоты, и оставляют на 24 ч при 0 - +4^oC. Затем пептид лиофилизуют и хроматографируют на ДЕАЕ-сефадексе А-25 в ацетатной форме в 0,3 М ацетата аммония. Фракции, содержащие пептид δ -сна, лиофилизуют и получают 1,60 г (1,84 ммоль, 90%) пептида I.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать с высоким выходом пептид δ -сна высокой степени чистоты.

Формула изобретения

Способ получения пептида δ-сна формулы I Trp-Ala-Gly-Gly -Asp-Ala-Ser-Gly-Glu, включающий конденсацию N_α- защищенного C-активированного тетрапептида Trp-Ala-Gly-Gly с пентапептидом Asp-Ala-Ser-Gly-Glu с последующим снятием защитной группы и хроматографической очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве N_α- защищенного C-активированного тетрапептида используют пентафторфениловый эфир Boc-защищенного тетрапептида формулы II
Boc-Trp-Ala-Gly-Gly OPfp,
конденсацию осуществляют в диметилформамиде в присутствии N-метилморфолина, а удаление Boc-группы - с помощью муравьиной кислоты при (-2) - (+8)^oС.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2