3'-оксимино-2',3'-дидезоксинуклеозиды

 

Изобретение касается новых производных 3'-оксимино-2',3'-дидезоксинуклеозидов формулы: где B - незамещенный или замещенный тимин-1-ил, урацил-1-ил, цитозин-1-ил, аденин-9-ил и гуанин-9-ил, а R - C₁-C₆алкил, C₆-C₉арил или C₁-C₆ацил. 3 табл., 2 ил.

Изобретение относится к области органической химии и вирусологии и касается новых аналогов нуклеозидов, содержащим в качестве углеводной компоненты 3-оксимино-2-дезоксирибофуранозу, 3-ацилоксимино-2-дезоксирибофуранозу (ацил= ацетил, пропионил, изобутирил, пивалоил, бензоил и др.) или 3-метоксимино-2-дезоксирибофуранозу, обладающие противовирусной активностью широкого спектра действия в отношении вирусов иммунодефицита человека (ВИЧ), простого герпеса (ВПГ) и вируса гепатита Б (ВГБ), которые могут найти применение в медицине.

Известно применение ретровира (зидовудин, AZT, 3'-азидо-2',3'- дидезокситимидин) для лечения пациентов с синдромом приобретенного иммунодефицита [1].

Известно применение ацикловира (ACG, зовиракс) для лечения заболеваний, вызванных вирусом простого герпеса [1].

Также известно применение эпивира (³TC) для лечения синдрома приобретенного иммунодефицита человека и его активность в отношении вируса гепатита [2].

Технической задачей изобретения является создание новых аналогов нуклеозидов, обладающих противовирусной активностью широкого спектра действия, более избирательным противовирусным действием а также отсутствием резистентности к этим аналогам со стороны мутантных штаммов вирусов или клеток, дефицитных в отношении фосфорилирующих ферментов.

Соединения по изобретению получены известными в органической химии методами, такими как окисление, оксимирование, ацилирование, введение защитных групп и их удаление в соответствии со схемами 1 и 2. Формулы и нумерация некоторых синтезированных соединений приведены на фиг. 1. Синтез 3'-оксимино-2'-3'-дидезоксинуклеозидов ведут из природных нуклеозидов, содержащих 2-дезоксирибофуранозу в качестве углеводной компоненты. Положение 5' 2-дезоксирибофуранозы защищают монометокситритильной, диметокситритильной или третбутилдиметилсилильной группой, затем окисляют гидроксил в положении 3' в кето-группу (окислитель - пиридиния дихромат или реактив Десс-Мартина), оксимируют in situ (гидроксиламина гидрохлорид в пиридине) и удаляют защитную группу в положении 5'. Выход 30 - 70%. Вирусологические испытания показывают, что 3'-оксимино-2'-3'-дидезоксинуклеозиды, в особенности 3'-оксимино-2', 3'-дидезокситимидин, обладают активностью против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), вируса гепатита Б и вируса простого герпеса (ВПГ). Соединения демонстрируют антиВИЧ активность в клетках, дефектных по тимидинкиназе, а также активность против штаммов ВПГ, дефектных по тимидинкиназе.

Пример 1. Синтез 3'-оксимино-2'3'-дидезоксинуклеозидов, 3'-ацетоксимино-2'3'-дидезоксинуклеозидов и 3'-метоксимино-2'3'-дидезоксинуклеозидов, содержащих 5-замещенные производные урацила в качестве нуклеиновых оснований (на примере производных тимина).

3'-Кето-2'3'-дидезокситимидин 29 был синтезирован [3], окисление реагентом Десс-Мартина проводили [4]. ЯМР-спектры были получены на спектрометре Bruker AC 250 в растворе CDCl₃ или D₂O с использованием TMC или ацетонитрила соответственно в качестве внутреннего стандарта. В описании спектров использованы следующие сокращения: с - синглет, дд - дублет дублетов, ддд - дублет дублетов дублетов, м - мультиплет, к - квартет, пт - псевдотриплет. Сигналы защитных групп не приводились при описании спектров. Масс-спектры снимались в позитивном или негативном режиме на спектрометре Jeol DX 300 с операционной системой JMA-DA 5000 и использованием нитробензилового спирта в качестве матрицы.

УФ-спектры были получены на Uvicon-931 спектрофотометре в воде. TCX проводилась на пластинах с силикагелем (Merck, Art. 5554). Колоночная хроматография проводилась на Silica Gel 60 (Merck, Art. 15111) с использованием дихлорметанана и метанола в качестве элюентов. Температуры плавления были измерены на аппарате Reichter (Австрия) и не были исправлены. Обращенно-фазовая хроматография проводилась на LiChroprep RP-18 (40-63 мкм, Merck, Art. 13900). Рентгеновская съемка была выполнена на дифрактометре CAD-4 (Nonius, Голландия)). Структуры были решены прямым методом и уточнены методом наименьших квадратов с анизотропным приближением для неводородных атомов. Координаты водородных атомов были определены из разностных синтезов Фурье и уточнены с использованием изотропных температурных факторов. Окончательные значения R-факторов были 4,2% и 3,0% для соединений 1E и 2Z соответственно. Кристаллы этих соединений были получены из воды.

5'-Монометокситритил-3'-оксимино-2', 3'-дидезокситимидин (30E + 30Z). К насыщенному раствору гидроксиламина гидрохлорида в пиридине (5 мл) было добавлено соединение 29 (1,45 г, 2,83 ммоль). Через 15 мин реакционная смесь была упарена в вакууме, и к остатку были добавлены дихлорметан (50 мл) и вода (50 мл). После экстракции органический слой был высушен безводным сульфатом натрия, упарен и переупарен с толуолом. После колоночной хроматографии на силикагеле (градиент метанола в дихлорметане, 0_→2,5%) было получено 1,39 г смеси 30E+30Z в виде бесцветной пены (93%).

¹H ЯМР(CDCl₃): 30E 7,62 к (H6, 1H), 7,20 пт (H1', 1H), 4,70 м (H4', 1H), 3,61 дд (H5', J_5',4' = 3,0 Hz, J_5',5'' = -10,5 Hz, 1H), 3,48 дд (H5'', J_5'',4'= 1,8 Hz, 1H), 3,55 дд (H2'', J_2'',1'=6,8 Hz, J_2'',2'=-18,7 Hz, 1H), 2,79 ддд (H2', J_2',1'=7,7 Hz, J_2',4'=1,9 Hz, 1H), 1,36 д (Me-C5, 3H). 30Z 7,76 к (H6, 1H), 6,39 пт (H1', 1H), 4,94 м (H4', 1H), 3,94 дд (H5', J_5',4'= 1,7 Hz, J_5',5''=-10,2 Hz, 1H), 3,29 дд (H5'', J_5'',4'=1,9 Hz, 1H), 3,23 дд (H2'', J_2'',1'=6,5 Hz, J_2'',2'=-16,0 Hz, 1H), 3,06 ддд (H2', J_2',1'=9,2 Hz, J_2',4'=1,9 Hz, 1H), 1,29 д (Me-C5, 3H). m/e (FAB MS<0) 527 (M-H)^-.

3'-Оксимино-2', 3'-дидезокситимидин (1E). Раствор смеси соединений 30E+30Z (193 мг, 0,37 ммоль) в 80%-ной водной уксусной кислоте (5 мл) перемешивали в течение 12 ч при комнатной температуре, упаривали досуха и переупаривали с толуолом. К остатку добавляли воду (5 мл), дихлорметан (5 мл), водный слой отделяли и промывали дихлорметаном (5 мл), фильтровали через влажный бумажный фильтр и упаривали досуха. Остаток очищали обращенно-фазовой хроматографией (градиент метанола в воде, 0_→5%). После лиофильной сушки было получено 64 мг соединения 1E в виде бесцветной пены (68%).

Последующая кристаллизация из воды позволила получить 43 мг кристаллического 1E. T. пл. 117-119^oC. ¹H ЯМР (D₂O): 7,57 к (H6, 1H), 6,31 пт (H1', 1H), 4,64 м (H4', 1H), 3,89 дд (H5', J_5',4'=2,7 Hz, J_5',5''=-12,8 Hz, 1H), 3,82 дд (H5'', J_5'',4'=4,1 Hz, 1H), 3,30 дд (H2'', J_2'',1'=7,4 Hz, J_2'',2'= -19,1 Hz, 1H), 2,90 ддд (H2', J_2',1'=6,3 Hz, J_2',4'=1,6 Hz, 1H), 1,82 д (Me-C5, 3H). ¹³C ЯМР (20% CD₃OD в H₂O): 168,2 (C4), 161,6 (C3'), 153,4 (C2), 139,2 (C6), 113,8 (C5), 85,1 (C1'), 81,0 (C4'), 62,4 (C5'), 34,9 (C2'), 12,6 (Me-C5). m/e (FAB MS<0) 254 (M - H)^-, (FAB MS>0) 256 (M+H)⁺. УФ: λ_max = 267 нм (ε 964000).

Элементный анализ: C₁₀H₁₃N₃O₅·H₂O.

Найдено, %: C 43,65; H 5,47; IN 15,37; Вычислено, %: C 43,96; H 5,52; IN 5,37.

Рентгеноструктурный анализ: конформационные параметры 1E, представлены в табл. 1. Трехмерная структура E1 представлена на фиг. 2.

5'-Монометокситритил-3'-метоксимино-2', 3'-дидезокситимидин (31E+31Z). Реакция соединения 29 (1,45 г, 0,88 ммол) с насыщенным раствором О-метилгидроксиламина гидрохлорида в пиридине (2 мл) с последующей очисткой на силикагеле (градиент метанола в дихлорметане, 0 _→ 2%, как описано для 30E+30Z позволила получить 431 мг смеси 31E+31Z в виде бесцветной пены (91%). ¹H ЯМР (CDCl₃): 31E 7,58 к (H6, 1H), 6,38 дд (H1', 1H), 4,65 м (H4', 1H), 3,97 с (N-OMe, 3H), 3,59 дд (H5', J_5',4'=3,1 Hz, J_5',5''=-10,4 Hz, 1H), 3,40 дд (H5'', J_5'',4'=2,0 Hz, 1H), 3,44 дд (H2'', J_2'',1'=6,8 Hz, J_2'',2'=-18,5 Hz, 1H), 2,72 ддд (H2', J_2',1'=7,6 Hz, J_2',4'=2,0 Hz, 1H), 1,37 д (Me-C5, 3H). 31Z 7,74 к (H6, 1H), 6,39 дд (H1', 1H), 4,82 м (H4', 1H), 3,89 с (N-OMe, 3H), 3,84 дд (H5', J_5',4'= 1,8 Hz, J_5',5''=-10,2 Hz, 1H), 3,23 дд (H5'', J_5'',4'= 1,5 Hz, 1H), 3,19 дд (H2'', J_2'',1'=6,3 Hz, J_2'',2'=-16,3 Hz, 1H), 3,03 ддд (H2', J_2',1'=8,9 Hz, J_2',4'=1,3 Hz, 1H), 1,30 д (Me-C5, 3H). m/e (FAB MS < 0) 540 (M-H)^-.

3'-Метоксимино-2',3'-дидезокситимидин (2E+2Z [5]. Раствор смеси соединений 31E+31Z (222 мг, 0,41 ммоль) в 80%-ной водной уксусной кислоте (5 мл) перемешивали в течение 12 ч при комнатной температуре и обрабатывали, как описано для соед. 1E. Остаток очищали обращенно-фазовой хроматографией (градиент метанола в воде, 0_→7%). После лиофильной сушки было получено 79 мг смеси соединений 2E+2Z в виде бесцветной пены (72%). Последующая кристаллизация из воды позволила получить 45 мг кристаллического 2Z. T. пл. 121-123^oC. ¹H ЯМР (D₂O): 2E 7,55 к (H6, 1H), 6,28 дд (H1', 1H), 4,68 м (H4', 1H), 3,86 с (N-OMe, 3H), 3,90 дд (H5', J_5',4'=2,9 Hz, J_5',5''=-13,0 Hz, 1H), 3,82 дд (H5'', J_5'',4'=4,3 Hz, 1H), 3,28 дд (H2'', J_2'',1'=7,3 Hz, J_2'',2'= -19,2 Hz, 1H), 2,92 ддд (H2', J_2',1'=6,1 Hz, J_2',4'=1,9 Hz, 1H), 1,82 д (Me-C5, 3H). 2Z 7,71 к (H6, 1H), 6,27 дд (H1', 1H), 4,65 м (H4', 1H), 3,82 с(N-OMe, 3H), 4,08 дд (H5', J_5',4'=3,3 Hz, J_5',5''=-12,6 Hz, 1H), 3,80 дд (H5'', J_5'',4'=2,3 Hz, 1H), 3,08 дд (H2'', J_2'',1'=6,5 Hz, J_2'',2'=-17,4 Hz, 1H), 2,90 ддд (H2', J_2',1'=8,2 Hz, J_2',4'=1,8 Hz, 1H), 1,84 д (Me-C5, 3H). ¹³С ЯМР (20% CD₃OD в H₂O): 2E 166,9 (C4), 159,5 (C3'), 152,0 (С2), 139,0 (C6), 112,1 (C5), 84,6 (C1'), 79,8 (C4'), 62,3 (C5'), 61,1 (OMe), 33,1 (C2'), 11,9 (Me-C5). 2Z 166,8 (C4), 159,8 (C3'), 152,1 (C2), 137,7 (C6), 112,7 (C5), 83,4 (C1'), 79,6 (C4'), 62,4 (C5'), 60,8 (OMe), 35,0 (C2'), 12,0 (Me-C5). m/e (FAB MS<0) 268 (M-H)^-, (FAB MS>0) 270 (M+H)⁺. УФ: λ_max = 267 нм (ε 96500).

Элементарный анализ: C₁₁H₁₅N₃O₅·1,5H₂O.

Найдено, %: C 44,59; H 5,93; N 13,93; Вычислено, %: C 44,59; H 6,12; N 14,18.

Рентгеноструктурный анализ: конформационные параметры 2Z представлены в табл. 1. Трехмерная структура 2Z представлена на фиг. 2.

5'-Монометокситритил-3'-ацетоксимино-2',3'-дидезокситимидин (32E+32Z). К раствору смеси 30E+30Z (460 мг, 0,87 ммоль) в пиридине ( 5 мл) при перемешивании при 0^oC был добавлен ацетил хлорид (71 мкл, 1,0 ммоль). Реакционной смеси дали согреться до комнатной температуры и через 6 ч добавили насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия (2 мл). Раствор был упарен, и остаток был обработан и очищен на силикагеле, как описано для 30E+30Z (градиент метанола в дихлорметане, 0_→2%. Было получено 327 мг смеси 32E+32Z в виде бесцветной пены (66%). ¹H ЯМР (CDDl₃): 32E 7,60 к (H6, 1H), 6,28 дд (Hl', 1H), 4,82 м (H4', 1H), 3,74 дд (H5', J_5',4'=3,0 Hz, J_5',5''=-10,7 Hz, 1H), 3,48 дд (H5'', J_5'',4'=2,1 Hz, 1H), 3,62 дд (H2'', J_2'',1'=6,5 Hz, J_2'',2'= -18,6 Hz, 1H), 3,13 ддд (H2', J_2',1'=7,8 Hz, J_2',4'=1,8 Hz, 1H), 2,23 с (N-OCOMe, 3H), 1,37 д (Me-C5, 3H). 32Z 7,73 к (H6, 1H), 6,48 дд (H1', 1H), 4,92 м (H4', 1H), 3,94 дд (H5', 1H), 3,47 дд (H5'', J_5'',4'=1,8 Hz, J_5',5''= -10,4 Hz, 1H), 3,39 дд (H2'', J_2'',1'=6,1 Hz, J_2'',2'=-17,1 Hz, 1H), 3,18 ддд (H2', J_2',1'= 9,2 Hz, J_2',4'=1,1 Hz, 1H), 1,94 c (N-OCOMe, 3H), 1,34 д (Me-C5, 3H). m/e (FAB MS < 0) 568 (M-H)^-.

3'-Ацетоксимино-2',3'-дидезокситимидин (3E+3Z). Раствор смеси соединений 32E+32Z (340 мг, 0,60 ммоль) в 80%-ной водной уксусной кислоте (5 мл) перемешивали в течение 12 ч при комнатной температуре и обрабатывали, как описано для соединения 1E. После очистки хроматографией на силикагеле (градиент ацетона в дихлорметане, 0_→50% и лиофильной сушки было получено 110 мг смеси соединения 3E+3Z в виде бесцветной гигроскопичной пены (62%).

¹H ЯМР (D₂O): 3E 7,58 к (H6, 1H), 6,30 пт (H1', 1H), 4,78 м (H4', 1H), 3,98 дд (H5', J_5',4'=2,7 Hz, J_5',5''=-16,0 Hz, 1H), 3,91 дд (H5'', J_5'',4'= 3,9 Hz, 1H), 3,50 дд (H2'', J_2'',1'=7,4 Hz, J_2'',2'=-19,6 Hz, 1H), 3,13 ддд (H2', J_2',1'=6,2 Hz, J_2',4'=1,3 Hz, 1H), 2,16 с (N-OCOMe, 3H), 1,83 д (Me-C5, 3H). 3Z 7,73 к (H6, 1H), 6,34 дд (H1', 1H), 5,00 м (H4', 1H), 3,98 дд (H5', J_5',4' =3,2 Hz, J_5',5''=-12,9 Hz, 1H), 3,92 дд (H5'', J_5'',4'=2,8 Hz, 1H), 3,25 дд (H2'', J_2'',1'=6,3 Hz, J_2'',2'=-17,7 Hz, 1H), 3,10 ддд (H2', J_2',1'=8,2 Hz, J_2',4'=1,3 Hz, 1H), 1,82 с (N-OCOMe, 3H), 1,83 д (Me-C5, 3H). ¹³C ЯМР (20% CD₃OD в H₂O): 3E 172,0 (COCH₃), 168,9 (C3'), 162,9 (C4), 152,0 (C2), 138,3 (C6), 112,2 (C5), 84,9 (C1'), 80,4 (C4'), 62,1 (C5'), 34,5 (C2'), 19,0 (COCH₃), 11,9 (Me-C5). m/e (FAB MS<0) 296 (M-H)^-, (FAB MS>0) 298 (M+H)⁺. УФ: λ_max = 267 нм (ε 95900).

Элементный анализ: C₁₂H₁₅N₃O₆·H₂O.

Найдено, %: C 45,73; H 5,25; N 13,20; Вычислено, %: C 45,72; H 5,43; N 13,32.

Пример 2. Синтез 3'-оксимино-2',3'-дидезоксинуклеозидов и ацетоксимино-2',3'-дидезоксинуклеозидов, содержащих цитозин, аденин и гуанин в качестве нуклеиновых оснований (на примере производных аденина).

N⁶-Диметокситритил-5'-третбутилдиметилсилил-3'-оксимино-2', 3'-дидезоксиаденозин (34E+34Z). К раствору N⁶-диметокситритил-5'-третбутилдиметилсилил-2'- дезоксиаденозина 33 (447 мг, 0,67 ммоль) в дихлорметане (6 мл) при 0^oC был добавлен реактив Десс-Мартина (530 мг, 1,25 ммоль) в дихлорметане (6 мл) и пиридин (0,1 мл). Раствору позволили согреться до комнатной температуры и через 30 мин добавили насыщенный водный раствор тиосульфата натрия (5 мл). Органический слой был отделен, насыщенный раствор гидроксиламина гидрохлорида в пиридине (2 мл) был добавлен, и раствор был упарен в вакууме и переупарен с толуолом. К остатку был добавлен насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия (10 мл) и дихлорметан (10 мл). Органический слой после экстракции был промыт водой (2х10 мл), высушен с сульфатом натрия и упарен досуха. После очистки хроматографией на силикагеле (градиент метанола в дихлорметане, содержащем следы триэтиламина, 0_→2%) было получено 227 мг смеси 34E+34Z в виде бесцветной пены (49,8%). ¹H ЯМР (CDCl₃): 34E 8,18 с (H8, 1H), 8,05 с (H2, 1H), 6,42 пт (H1', 1H), 4,98 м (H4', 1H), 4,03 дд (H5', J_5',4' = 2,3 Hz, J_5',5''=-11,4 Hz, 1H) 3,88 дд (H5'', J_5'',4' =4,1 Hz, 1H), 3,54 дд (H2'', J_2'',1'=7,0 Hz, J_2'',2' =-18,4 Hz, 1H), 3,09 ддд (H2', J_2',1'=6,7 Hz, J_2',4'=1,9 Hz, 1H). 34Z 8,29 с (H8, 1H), 8,05 с (H2, 1H), 6,36 дд (H1', 1H), 4,66 м (H4', 1H), 4,22 дд (H5', J_5',4' =2,4 Hz, J_5',5''=-11,0 Hz, 1H), 4,02 дд (H5'', J_5'',4'=2,1 Hz, 1H), 3,24 дд (H2'', J_2'',1'=6,0 Hz, J_2'',2'=-15,9 Hz, 1H), 3,03 ддд (H2', J_2',1'=8,9 Hz, J_2',4'=1,6 Hz, 1H. m/e (FAB MS<0) 680 (M-H)^-.

3'-Оксимино-2',3'-дидезоксиаденозин (14E+14Z). К раствору смеси соединений 34E+34Z (226 мг, 0,33 ммоль) в тетрагидрофуране (5 мл) при 0^oC был добавлен 1,1 M раствор тетрабутиламмония фторида в тетрагидрофуране (0,33 мл). Раствору позволили согреться до комнатной температуры и упарили досуха. После очистки хроматографией на силикагеле (градиент метанола в дихлорметане 0_→4%, содержащем следы триэтиламина) и упаривания остаток был растворен в 20 мл 80%-ной водной уксусной кислоты, перемешан 30 мин, упарен и дважды переупарен с толуолом. К остатку была добавлена вода (10 мл) и дихлорметан (10 мл). Водный слой был отделен и промыт дихлорметаном (3х10 мл). После лиофилизации водного слоя получено 64 мг смеси 14E+14Z в виде бесцветной пены (73,5%). ¹H ЯМР (CDCl₃): 14Е 8,29 с (H8, 1H), 8,16 с (H2, 1H), 6,50 пт (H1', 1H), 4,70 м (H4', 1H), 3,96 дд (H5', J_5',4'=2,4 Hz, J_5',5'',=-12,6 Hz, 1H), 3,84 дд (H5'', J_5'',4'=4,0 Hz, 1H), 3,58 дд (H2'', J_2'',1'=7,1 Hz, J_2'',2= -18,7 Hz, 1H), 3,48-3,25 м (H2', 1H). 14Z 8,26 с (H8, 1H), 8,16 с (H2, 1H), 6,44 дд (H1', 1H), 4,70 м (H4', 1H), 4,21 дд (H5', J_5',4'=2,8 Hz, J_5',5''= -12,6 Hz, 1H), 3,92 дд (H5'', J_5'',4'=1,8 Hz, 1H), 3,48-3,25 м (H2', H2'', 2H). m/e (FAB MS<0) 263 (M-H)^-, (FAB MS>0) 265 (M+H)⁺. УФ: λ_max =260 нм ε 15000).

3'-Ацетоксимино-2', 3'-дидезоксиаденозин (15E+15Z). К раствору смеси 34E+34Z (82 мг, 0,095 ммоль) в пиридине (2 мл) при перемешивании при 0^oC был добавлен оцетил хлорид (18 мкл, 0,25 ммоль). Затем реакционной смеси дали согреться до комнатной температуры и через 1 ч добавили насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия (1 мл). Раствор был упарен в вакууме, и остаток был обработан и очищен на силикагеле, как описано для 32E+32Z (градиент метанола в дихлорметане 0_→3%), содержащем следы триэтиламина). К остатку (60 мг, 0,083 ммоль) в тетрагидрофуране (2 мл) при 0^oC был добавлен 1,1 М раствор тетрабутиламмония фторида (100 мкл) и далее поступали, как описано для 14E+14Z. После очистки хроматографией на силикагеле (градиент метанола в дихлорметане 0_→4%, содержащем следы триэтиламина), сухой остаток был растворен в 5 мл 80% водной уксусной кислоты и далее поступали, как описано для 14E+14Z. После лиофилизации получено 9 мг смеси 15E+15Z в виде желтоватой пены (32%). 1H ЯМР (CDCl₃): 15E 8,24 с (H8, 1H), 8,17 с (H2, 1H), 6,48 пт (H1', 1H), 4,66 м (H4', 1H), 3,90 дд (H5', J_5',4'=2,4 Hz, J_5',5''=-12,2 Hz, 1H), 3,80 дд (H5'', J_5'',4= 4,1 Hz, 1H), 3,67 дд (H2'', J_2'',1'=6,9 Hz, J_2'',2'= -18,8 Hz, 1H), 3,55 ддд (H2', J_2',1'=6,9 Hz, J_2',4'=1,7 Hz, 1H), 2,20 с (N-OCOMe, 3H). 15Z 8,30 с (H8, 1H), 8,17 с (H2, 1H), 6,42 дд (H1', 1H), 4,60 м (H4', 1H), 3,98 дд (H5', J_5',4'=2,6 Hz, J_5',5''=-12,3 Hz, 1H), 4,92 дд (H5'', J_5'',4'=4,0 Hz, 1H), 3,48 м (H2'', 1H), 3,05 м (H2', 1H). m/e (FAB MS<0) 305 (M-H)^-, (FAB MS>0) 307 (M+H)⁺. УФ: λ_max =260 нм ε 14800).

Пример 3. Определение противовирусной активности и цитостатического действия в культурах клеток.

Изучение противовирусной активности. Противовирусные исследования за исключением исследований с ВИЧ-1 и ВИЧ-2 основывались на ингибировании вирус-индуцированной цитопатогенности в культурах клеток E₆SM или HEL [6-7]. Соответствующие культуры клеток в микролитровых количествах были инокулированы со 100 CCID₅₀ вируса. При этом 1 CCID₅₀ вируса было достаточным для инфицирования 50% культуры клеток. После периода абсорбции (1 ч) остаточный вирус был удален, и клеточные культуры были ингибированы в присутствии различных концентраций (400, 200, 100,... мкг/мл) исследуемых соединений. Цитопатогенное действие вируса оценивалось по завершению цитопатогенного процесса в контрольной инфицированной вирусом культуре клеток.

Ингибирование ВИЧ-индуцированного образования синцития. Культура клеток CEM была суспендирована в концентрации 250.000-300.000 клеток/мл культуральной среды и инфицирована 100 CCID₅₀ ВИЧ-1 (III_B) или ВИЧ-2 (ROD). Затем 100 мкл суспензии инфицированных клеток были перенесены в планшет на 200 мкл, содержащий по 100 мкл соответственно разбавленных растворов исследуемых соединений. Через 4 дня инкубации при 37^oC образование синцития в культурах клеток было изучено [8].

Изучение цитостатической активности. Цитостатическая активность была изучена [9] . Цитостатическую активность выражали, как концентрацию соединения, которая уменьшает число выживших клеток на 50% (CC₅₀). Измерения цитотоксичности основывались на микроскопически видимом изменении нормальной клеточной морфологии (E₆SM) или ингибировании нормального роста клеток (HEL) [10].

Активность против вируса гепатита Б. Человеческие клетки 2.2.15, зараженные ВГБ, были выделены из клеточной линии HEP G2 и культивированы [11]. Клетки, культивируемые в модифицированной среде Дубелько с добавлением 4% бычьей сыворотки и 0,5 мМ глютамина, обрабатывали исследуемыми веществами в течение 9 дней. Культуральную жидкость меняли каждые 3 дня. Клетки HEP G2 и необработанные 2.2.15 клетки служили в качестве негативного и позитивного контроля соответственно. Затем среда была удалена и клетки лизированы. Полная внутриклеточная ДНК была выделена и подвергнута анализу "Саузерн блот", используя ³²P-меченую специфическую пробу (pTHBV плазмида содержит геном ВГБ полной длины). Определяли ингибирование вирусного репликативного ДНК-интермедиата в обработанных клетках в сравнении с контролем. Изучение цитотоксичности соединений проводили в клетках HEP G2, находящихся в планшете, измерением проникновения в клетки нейтрального красного красителя. Клетки были подсчитаны и обработаны в тех же условиях, что и клетки, использованные для определения противовирусной активности.

Результаты.

Активность против ВИЧ. АнтиВИЧ активность синтезированных соединений была изучена с использованием ВИЧ-1 (штамм III_B и ВИЧ-2 (штамм ROD) в культурах человеческих MT-4, CEM/0 и CEM/TK^- клеток (табл. 1). Соединения 1E, 3E+3Z показали выраженную активность как против ВИЧ-1, так и ВИЧ-2 в культурах клеток MT-4 и CEM/0. При этом активность против ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в MT-4 клетках была в 10-20 раз выше, чем в CEM/0 клетках. Цитостатическая активность исследуемых соединений была в 5-15 раз выше для MT-4 клеток, чем для CEM/0 клеток.

3'-Метоксимино-2', 3'-дидезокситимидины 2E+2Z были менее активны. Соединения 1E, 3E+3Z также проявили активность в культуре клеток CEM/TK^-, дефицитных по тимидинкиназе (EC₅₀ 20 мкг/мл и ≥ 20 мкг/мл), в то время как AZT был полностью неактивен в этой линии клеток.

3'-Ацилоксиминопроизводные-2',3'-дидезоксинуклеозидов (соединения 4a-4e) показали сходные величины ингибирующих концентраций.

3'-Оксимино-2', 3'-дидезоксинуклеозиды, содержащие природные нуклеиновые основания отличные от тимина (соединения 11E+11Z, 14E+14Z, 15E+15Z) также показали антиВИЧ активность в CEM клетках, хотя и меньшую, чем 1E и 3E+3Z. Соединения 11E+11Z были столь же активны в культуре CEM-TK^- клеток, как и CEM/0 клеток (EC₅₀ 16-19 мкл/мл и 58 мкг/мл соответственно), что подтверждает, что их активность не зависит или мало зависит от внутриклеточного фосфорилирования, катализируемого тимидинкиназой, а механизм действия отличается от обычного механизма действия, присущего нуклеозидным аналога и связанного с последующим клеточным фосфорилированием.

Активность против ВПГ. АнтиВПГ активность синтезированных соединений была изучена с использованием четырех штаммов ВПГ-1 и трех штаммов ВПГ-2 в культурах E₆SM и HEL клеток (табл. 2). Соединение 1E показало выраженные ингибиторные свойства в отношении ряда штаммов ВПГ-1 (EC₅₀ 0,4-1,3 мкг/мл) и несколько меньшую активность в отношении ВПГ-2 (EC₅₀ 0,5-11,0 мкг/мл). Соединения 1E и 3E+3Z были менее токсичны для клеток, в которых изучалась антигерпетическая активность (> 400 мкг/мл и 400 мкг/мл соответственно), чем ACG и 5-(E)-бромвинил-2'-дезоксиуридин (BVDU) (≥400 мкг/мл и ≥300 мкг/мл соответственно) (табл. 1).

3'-Ацилоксиминопроизводные-2',3'-дидезоксинуклеозидов (соединения 4a-4e) показали сходные величины ингибирующих концентраций.

Соединения 1E и 3E+3Z оказались неактивными по отношению к штамму ВПГ-1 (TK^-) (B2006), дефицитному по тимидинкиназе, а соединения 2E+2Z ко всем изученным штаммам ВПГ, за исключением незначительной активности к штаммам ВПГ-1 (KOS) и ВПГ-2 (Lyons) в HEL клетках с величинами EC₅₀ 50 мкг/мл и 35 мкг/мл соответственно.

Активность против вируса гепатита Б. Активность соединения 1E против ВГБ была изучена в культуре человеческих клеток линии 2.2.15, зараженных ВГБ. Соединения 1E и 4a показали значительную активность против вируса гепатита Б с EC₅₀ 0,25 мкг/мл и 1,5 мкг/мл соответственно, ингибируя вирусный репликативный ДНК-интермедиат в сравнении с контролем и не проявили цитотоксичности до концентрации 50 мкг/мл и 200 мкг/мл соответственно (SI>200). 3'-Оксимино-2',3'-дидезоксинуклеозиды, содержащие другие природные нуклеиновые основания (соединения 11E+11Z, 14E+14Z и 17E+17Z) также показали активность против ВГБ с несколько меньшими величинами EC₅₀ 10 мкг/мл, 10 мкг/мл и 7 мкг/мл соответственно.

Активность в отношении других вирусов. Исследуемые соединения не проявили активности и цитотоксичности против ряда ДНК- и РНК-вирусов, а именно: coxsackie virus, poliovirus, parainfluenza-3, reovirus-1, sindbis, semiliki forest, cytomegalovirus в различных культурах клеток (E₆SM, HeLa, Vero, HEL). Соединения 1E, 3E+3Z, а также некоторые соединения структуры 4 показали низкую активность против varicella zoster virus с величинами EC₅₀ 20-50 мкг/мл.

Цитотоксические свойства. Данные изучения цитотоксической активности показывают, что соединения по изобретению являются умеренно токсичными для культур клеток CEM/0 и MT-4 и малотоксичными в отношении E₆SM, HEL и культур клеток HEP G2.

Таким образом: 3'-оксимино-2',3'-дидезоксинуклеозиды показывают значительную активность против следующих вирусов ВИЧ-1 и ВИЧ-2, вирус гепатита Б, ВПГ-1 и ВПГ-2, сопоставимую с активностью соединений, используемых в медицине для терапии заболеваний, вызываемых этими вирусами (до сих пор не имеется ни одного коммерческого препарата для лечения ВГБ); соединение 1E является первым примером нуклеозидного аналога, показывающего активность против трех различных классов вирусов [9-(2-фосфонилметоксиэтил)аденин (PMEA) активен против ВИЧ и ВПГ, но неактивен в отношении вируса гепатита Б; ³ТС активен против ВИЧ и вируса гепатита Б, но неактивен против ВПГ]; одним из механизмов возникновения резистентности к актиВИЧ нуклеозидным аналогам и, в частности, к AZT является потеря способности подвергаться фосфорилированию человеческой тимидинкиназой в клетках, что исключает их дальнейшее последовательное превращение в активный нуклеозид-5'-трифосфат. Частичное сохранение антиВИЧ активности в CEM/TK^- клетках тиминовыми оксимино-нуклеозидами 1E и 3E+3Z и практически полное сохранение активности цитозиновыми нуклеозидами 11E+11Z косвенно свидетельствует об отличиях в их механизмах действия по сравнению со структурными аналогами, что может позволить избежать проблемы клеточной резистентности при химиотерапии 3'-оксимино-2',3'-дидезоксинуклеозидами;
в связи с возникновением штаммов вируса, резистентных к применяемым в настоящее время нуклеозидным аналогам, является актуальным изучение возможности химиотерапии другими аналогами нуклеозидной природы;
наиболее активные соединения по изобретению - 1E, его ацетильные производные 3E+3Z являются синтетически легко доступными соединениями. Так, 1E синтезируется из тимидина в 3 стадии с неоптимизированным суммарным выходом 63%.

Формула изобретения

1. 3'-Оксимино-2',3'-дидезоксинуклеозиды общей формулы I

где B - незамещенный или замещенный тимин-I-ил, урацил-I-ил, цитозин-L-ил, аденин-9-ил, гуанин-9-ил;
R - C₁-C₆-алкил или C₁-C₆-ацил.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7