Цитогенетический способ оценки функциональной активности т- лимфоцитов крови пациента

 

Использование: в медицине, иммунологии для оценки функциональной активности Т-лимфоцитов крови пациента. Сущность изобретения: из венозной крови пациента выделяют Т-лимфоциты. Лимфоциты культивируют на питательной среде с добавлением фитогемагглютинина в течение 48 ч. Добавляют колхицин до конечной его концентрации 0,5 мкг/мл и дополнительно культивируют в течение 2 ч. Культуральную жидкость центрифугируют. Супернатант обрабатывают гипотоническим раствором и повторно центрифугируют. Отцентрифугированные лимфоциты фиксируют и готовят их препараты на предметных стеклах. Подсчитывают количество лимфоцитов, содержащих не менее пяти акроцентриков (КЛ5) в одной акроцентрической ассоциации хромосом (ААХ), и количество лимфоцитов, не содержащих ААХ (КЛ0). Определяют процентное содержание указанных лимфоцитов от общего количества лимфоцитов, находящихся в метафазе. И при увеличении процентного содержания КЛ0 не менее чем на 20% по сравнению со значением указанного показателя, полученного у данного пациента ранее, и присутствии КЛ5 оценивают активность Т-лимфоцитов как адекватную. А при увеличении процентного содержания КЛ0 не менее чем на 60% по сравнению со значением указанного показателя, полученного у данного пациента ранее, и отсутствии КЛ5 или при снижении процентного содержания КЛ0 не менее чем на 60% и увеличении процентного содержания КЛ5 более чем в два раза по сравнению со значениями указанных показателей, полученными у данного пациента ранее, оценивают активность Т-лимфоцитов как пониженную. 1 ил., 9 табл.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения иммунореактивности организма человека, степени антигенности возбудителя заболевания, оценки тяжести и прогноза вариантов течения исходов заболевания, контроля за эффективностью проводимых лечебных мероприятий, диагностики иммунодефицитных состояний. В частности, предлагаемое изобретение может быть применено как в практических, так и научно-исследовательских медицинских разработках для оценки Т-клеточного иммунитета.

Аналогом предлагаемого изобретения является реакция бласттрансформации лимфоцитов (см. Фриммель Г. Иммунологические исследовательские методы. Медицина, 1987, с. 294-303). Метод дает возможность оценить пролиферативную способность лимфоцитов, требует минимального количества оборудования и реактивов для работы с культурой клеток. Но для оценки результатов тpебуется применение радиоизотопных методов исследования, т.е. работа с радиоактивностью, что предполагает необходимость дополнительного оборудования и специальных требований к помещению. Для оценки функциональной специфики клеточной популяции большое значение имеет определение соотношения разных классов лимфоцитов, различающихся по степени зрелости.

Также аналогом предлагаемого изобретения является метод определения биосинтетической активности лимфоцитов крови (см. автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук "Применение оптического клеточного зонда акридинового оранжевого в клинической иммунологии: его значение для диагностики заболеваний инфекционно-воспалительного характера", Завгородняя Е. Г., 1994, Министерство здравоохранения Российской Федерации, Московский научно-исследовательский институт уха, горла и носа). Сущность данного метода заключается в том, что определенные параметры функционального состояния иммунокомпетентных клеток крови определяются с помощью флюоресцентного зонда акридинового оранжевого. Данный метод позволяет определить соотношение рибонуклеиновой и дезоксирибонуклеиновой кислот фиксированной лимфоидной клетки посредством микроспектрофлюоресцентного анализа с последующим учетом результатов с помощью цифрового счетчика. Соотношение рибонуклеиновой кислоты к дезоксирибонуклеиновой кислоте в лимфоците, определяемое этим методом, характеризует меру его активности, то есть является показателем одного из параметров функционального состояния лимфоцитов. Таким образом, используемый метод позволяет с максимальной объективностью оценить результаты исследования. Недостатком данного метода является то, что, характеризуя пролифеpативную активность лимфоцитов, он не способен определить соотношение зрелых и незрелых клеток, участвующих в иммунном отсвете.

Аналогом предлагаемого изобретения является цитохимический метод оценки активности дегидрогеназ лимфоцитов (см. Клиническая лабораторная диагностика, 1993, N 2, c.42-43, статья Пастушенкова В.Л., Митина Ю.А. "Цитохимический метод оценки активности дегидрогеназа в лимфоцитах"). В данном методе нет необходимости в оборудовании для работы с культурой клеток, т. е. метод относительно прост, но точность метода очень низкая, поскольку активность дегидрогеназ является лишь косвенным показателем функционального состояния клетки.

Аналогом предлагаемого изобретения является способ определения активированных Т-лимфоцитов в крови (см. авт. св. СССР N 1024839A, кл. G 01 N 33/48, 1983). В данном способе выявлено наличие положительной корреляции между увеличением количества Т-лимфоцитов, содержащих от нуля до двух акроцентрических хромосом в ассоциации, с приростом специфических антител и количеством антигенчувствительных лимфоцитов у обследованных. В прототипе предлагается использование данного метода для оценки иммуногенности некоторых прививочных препаратов. Однако, подчеркивая связь частоты ассоциаций акроцентрических хромосом с активностью Т-клеточного иммунитета, не указывается на возможность и необходимость использования данного метода для более широкой характеристики иммунного состояния организма. Кроме того, существенным недостатком данного метода является использование только одного, двух показателей (процент отношения хромосом, вступивших в ассоциацию, к их общему количеству и частота клеток с разным количеством ассоциаций акроцентрических хромосом).

Целью предлагаемого изобретения является расширение функциональных возможностей.

На чертеже цитогенетический метод оценки функциональной активности Т-лимфоцитов проиллюстрирован в виде диаграммы, по оси абсцисс - доля клеток в%. Для проведения цитогненетического анализа хромосомных препаратов использовались образцы венозной крови в количестве до 5 мл, забираемой в септических условиях стерильной иглой одноразового пользования ("ЛУЕР") в стерильный пенициллиновый флакон, содержащий 0,2-0,4 мл раствора гепарина (фирма "Рихтер", Венгрия), в разведении раствором Хенкса из расчета на 1 мл цельной крови 25 ЕД гепарина. Гепаринизированную кровь в количестве 0,5 мл добавляли в культуральные флаконы с питательной смесью, в состав которой входили следующие компоненты: среда Игла с глутамином (6 мл), сыворотка крупного рогатого скота (0,5 мл), в качестве стимулятора пролиферативной активности лимфоцитов использовали фитогемагглютинин (ФГА, ПАНЭКО, Россия), разведенный до 5 мл стерильным раствором Хенкса (0,2 мл раствора ФГА на культуральный флакон). Для культивирования крови использовали растворы одной серии (чаще из одного флакона). Культуру лимфоцитов ставили по микрометоду (Stain technology, 1965, т. 40, N 6, c.333-338, статья Hungerford D.A. "Leukocytes-cultured from smoll inoculla of whole blood and the preparation of methaphase chromosomes by treatment with hypotonic KCl"). Для анализа ассоциаций акроцентрических хромосом (ААХ) кровь с питательной средой выдерживали при 37^oC в течение 48 ч с момента введения фитогемагглютинина, так как большинство клеток в это время находится в первом митозе (Цитология, 1975, т. 17, N 85, c. 924-929, статья Ждановой Н.С., Дерягина Г.В. "Зависимость частоты участия акроцентрических хромосом в образовании спутничных ассоциаций от длительности культивирования лимфоцитов человека с ФГА"). За 2 ч до фиксации в культуральные флаконы вводили колхицин в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. После центрифугирования и отсасывания супернатанта клетки подвергались гипотонической обработке 0,55%-ным раствором KCl при 37^oC в течение 10 мин. Затем пробирки центрифугировали, отсасывали супернатант и фиксировали охлажденным раствором Карнуа (метанол с уксусной кислотой в соотношении 3:1), производя не менее 3-х смен фиксатора. После получения полностью обесцвеченной клеточной суспензии готовили препараты хромосом путем раскапывания клеток на обезжиренные и охлажденные в дистиллированной воде предметные стекла. Препараты подсушивали над пламенем горелки без поджигания и шифровали. Для анализа ААХ препараты окрашивали водным раствором красителя Гимзы (0,1 мл красителя на 1 мл дистиллированной воды) в течение 8-10 мин. Микроскопический анализ ААХ проводили при стандартном светомикроскопическом тестировании препаратов в 100-200 клетках от каждого индивида. В препаратах хромосом учитывали следующие показатели, характеризующие ассоциативную способность акроцентриков: АИ - процент клеток с ААХ, ассоциативный индекс; А/М - процентное число ААХ на метафазу; D+G/M - число хромосом, участвующих в ААХ на метафазу; Кл0 - процентное число клеток без ААХ; Кл 0+2 - процентное число клеток с количеством акроцентриков не более двух в одной ААХ; Кл5> - процентное число клеток с пятью и более акроцентриками в одной ААХ. Поскольку на ФГА реагируют преимущественно Т-лимфоциты, определяющие клеточный характер иммунитета (Петров Р. В. Иммунология и иммуногенетика. -М.: Медицина, 1976), уровень ААХ в лимфоцитах, стимулирующих ФГА, указывает на активность Т-лимфоцитов в иммунитете. В сообщениях (Цитология, 1966, т. 8, N 8, c.169 - 178, статья Прокофьевой-Бельговской А. А. "Природа ассоциаций акроцентрических хромосом человека"; Цитология, 1967, т. 9, N 9, с. 853-863, статья Гиндилис В.М., Павулсоне С.А. "К вопросу о природе ассоциаций спутничных хромосом человека") отмечается, что процесс активной пролиферации лимфоцитов должен сопровождаться накоплением клонов клеток без ААХ, либо клеток не более чем с двумя акроцентриками в одной ААХ, а функционально зрелые клетки, длительно пребывающие в интерфазном состоянии, должны содержать крупные ассоциации (Кл5>). Поскольку такие показатели анализа ААХ, как Кл0, АИ, А/М, D+G/M и D/G взаимосвязаны, для дальнейшей интерпpетации данных мы использовали только значения Кл0 и Кл5> как наиболее информативные показатели.

При наличии антигенного стимула повышение Кл0 на 20% и более при наличии Кл5> свидетельствовало об адекватной функциональной активности Т-лимфоцитов, а увеличение Кл0 на 60% и выше при отсутствии Кл5> - об его угнетении, на которое также в случае отсутствия антигенного стимула указывало уменьшение Кл0 на 60% и выше при росте Кл5> более чем в два раза.

Контролем служили результаты цитогенетического анализа, проведенного в двух группах практически здоровых жителей г. Уфы: 31 человек в возрасте от 19 до 53 лет и 7 человека в возрасте 2 - 10 лет. В табл. 1 представлены показатели ААХ в контрольных группах, результаты которых изображены на чертеже (N-ноpма).

Статистический анализ показал отсутствие достоверных различий средних значений ААХ в представленных возрастных группах, что согласуется с данными других авторов (Цитология, 1966, т. 8, N 2, c. 158 - 168, статья Прокофьевой-Бельговской А. А., Гиндилис В.М., Гринберг К.Н. и др. "Ассоциация акроцентрических хромосом человека в зависимости от типа клеток и возраста организма"; Генетика, 1967, N 6, с. 79-85, статья Арагацуни К.В. "Ассоциации акроцентрических хромосом у лиц в возрасте 80 - 86 лет").

В качестве конкретных примеров выбрана группа детей с тяжелыми гнойно-септическими заболеваниями (перитонит, деструктивная пневмония, сепсис), получавших лечение в реанимационном отделении Республиканской детской клинической больницы г. Уфы в 1994 году, больные с острой почечной недостаточностью на фоне геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС), находящиеся на лечении в отделении гемодиализа Республиканской клинической больницы (РКБ), и пациенты с острой черепно-мозговой травмой и травматическим шоком отделения реанимации больницы N 22 г. Уфы. Обследованные были разделены на 5 групп (I, II, III, IV, V; результаты см. на чертеже). В первую группу вошли больные, находящиеся в состоянии септического шока с явлением полиорганной недостаточности (I гр. - септич. шок, см. чертеж).

Рассмотрим изменение цитогенетических показателей у больных данной группы (свободные результаты представлены на чертеже).

Пример 1. Больной К., 1 год 6 мес., находился на лечении в реанимационном отделении республиканской детской клинической больницы (РДКБ) с диагнозом разлитой гнойный перитонит, сепсис. 24.01.94 ребенок находится в крайне тяжелом состоянии, обусловленном септическим шоком. Отмечалось наличие выраженных признаков интоксикации: тахикардия, одышка, парез кишечника, токсическая энцефалопатия, гипопротеинемия, тенденция к анемии. Общий анализ крови: эритроциты (Er) 3,0·10¹²; гемоглобин (Hb) 109 г/л; гематокрит (Ht) 25; лейкоциты (L) 12,8·10⁹: юные (Ю) - 1%; палочкоядерные (П) - 5%, сегментоядеpные (С) - 66%; лимфоциты (ЛФ) - 18%; моноциты (М) - 10%; СОЭ - 35 мм/ч. Начато проведение антибактериальной терапии (мандол+гентамицин), иммуномодулирующей терапии (иммуноглобулин и свежезамороженная плазма), интенсивной инфузионной терапии, экстракорпоральные методы детоксикации. Цитогенетический анализ пpоводился по вышеописанной методике (см. табл.2).

У больного на момент обследования наблюдалось увеличение количества молодых профилирующих клеток (Кл0), наряду с этим обнаружено отсутствие зрелых лимфоцитов, содержащих крупные ассоциации (Кл5>).

Пример 2. Больная Е., 1 год 7 мес., находилась на лечении в отделении реанимации РДКБ с диагнозом: ожоговая болезнь, стадия септикопиемии, двусторонняя полисегментарная пневмония, остеомиелит малоберцовой кости, септический шок. Поступила 2.02.94 в состоянии септического шока. Проведено вскрытие гнойных очагов, начато проведение искусственной вентиляции легких (ИВЛ), продолжавшейся до 7.02.94, все это время состояние оценивалось как крайне тяжелое, нестабильное, с наличием незначительной положительной динамики. Выход из состояния септического шока наступил 7.02.94. Общий анализ крови от 3.02: Er 3,8·10¹²; Hb 128; Ht 36; L - 32,8·10⁹: C - 65%; Лф - 24%; M - 6%; СОЭ 29 мм/ч. Цитогенетическое обследование ребенка проводилось 4.02 и 7.02.94 (табл. 3).

В данном случае анализ ААХ вновь показал, что на фоне крайне тяжелого общего состояния в кровеносном русле у ребенка отсутствовали зрелые лимфоциты (Кл5>). Однако уровень Кл0 был значительно повышен по сравнению с контрольной группой, что позволяет сделать заключение о достаточно высокой пролифеpативной активности клеток. При повторном цитогенетическом анализе в кровеносном русле обнаруживались зрелые клетки, содержащие крупные ААХ (Кл5>), темпы пролиферации лимфоцитов имели тенденцию к снижению. Анализ субпопуляций Т-лимфоцитов больной показал снижение относительного содержания Т-хелперов и Т-супрессоров при нормальных значениях Т-лимфоцитов, что не соответствовало клинической картине развития заболевания на этом этапе. В дальнейшем благодаря интенсивной комплексной терапии состояние больной постепенно улучшалось и через 2 недели ребенок был переведен в терапевтическое отделение.

Пример 3. Больной Т., 1 год 7 мес., поступил в реанимационное отделение РДКБ 10.04.94 в крайне тяжелом состоянии с диагнозом: разлитой гнойный перитонит, сепсис, септикопиемическая форма, септическая пневмония, септический шок. С момента поступления начато проведения ИВЛ. Цитогенетическое обследование проводилось дважды - 11 и 12 апреля. 11.04 проводился плазмоферез, проводимые лечебные мероприятия положительного эффекта не оказали, 16.04.94 ребенок умер. Общий анализ крови 11.04.94: Er - 3,8·10¹²; Hb 122 г/л; Ht 36; L 8,0·10⁹: Э - 1%, П - 2%, С - 72%; Лф - 22%; М - 3%. Результаты цитогенетического обследования представлены в табл. 4.

Анализ ААХ при первом цитогенетическом обследовании показал резкую активацию темпов пролиферации лимфоцитов (повышение Кл0 составил 166%), в зрелых клеток обнаружено не было. Следовательно, при высокой генерации клеток процесс созревания лимфоцитов, по-видимому, был нарушен, свидетельствуя о неспособности к адекватному иммунному ответу лимфоцитов ввиду их незрелости. Повторный цитогенетический анализ, проведенный после начала интенсивной терапии, указывает на снижение темпов пролиферации, однако в отличие от предыдущего случая в крови больного по-прежнему отсутствовали зрелые клетки. Полученные результаты позволяют предположить что проводимые терапевтические мероприятия не оказали стимулирующего действия на иммунную систему, что возможно определило неблагоприятный исход заболевания.

Резюмируя вышеизложенное, следует подчеркнуть, что анализ цитогенетических показателей ААХ в лимфоцитах периферической крови (ЛПК) у больных, находящихся в критическом состоянии, обусловленном септическим шоком, показал, что под воздействием мощного антигенного стимула происходит значительное возрастание темпов пролиферации лимфоцитов. Наряду с этим количеством Кл5> резко снижается вплоть до полного исчезновения, что можно объяснить либо нарушением процесса созревания и дифференцировки Т-клеток, либо депонированием зрелых форм (Кл5>) в очаге и их интенсивной пролиферацией. Причем прогностически благоприятным признаком оказалось появление к кровеносном русле при повторном цитогенетическом обследовании Кл5>, по-видимому, прошедших этап созревания в периферических лимфоидных органах. Напротив, при повторном отсутствии среди ЛПК Кл5> исход заболевания оказался неблагоприятным.

Вторую группу обследованных составили больные, вышедшие из состояния септического шока, пока еще находящиеся в очень тяжелом нестабильном состоянии с сохранением катаболической направленности обмена веществ проявлениями вторичного иммунодефицита, высокой эндотоксемией, но при купировании явлений полиорганной недостаточности. Рассмотрим клинические примеры.

Пример 4. Больной Х., 3 года 6 мес., поступил в реанимационное отделение РДКБ с диагнозом; сепсис, септикопиемическая форма, септическая пневмония двухсторонний пневмоторакс, гнойный перикардит. 26.07.94 доставлен в РКДБ в состоянии септического шока. С 27.07 по 1.08 проводилось ИВЛ, дважды (27 и 29) плазмоферез. Общий анализ крови от 28.07.94 показал следующие результаты: Er 3,6·10¹²; Hb 105 г/л; Ht 38; L 27·10⁹: П - 4%, С - 45%; Лф - 36%; М - 14%. Результаты цитогенетических анализов представлены в табл. 5.

Результаты анализа ААХ показали, что у больного отмечалось усиление темпов генерации Т-лимфоцитов, в периферической крови имелись Кл5>. Повторный анализ ААХ проведен через неделю. На данный момент состояние пациента улучшилось и расценивалось как тяжелое, стабильное. Показатели клеточной пролиферации приближались к норме, в крови циркулировали зрелые лимфоциты (III группа).

В третью группу вошли больные 5, 6, 7, 8, 9, 10. Все больные этой группы на момент обследования находились в реанимационном отделении РДКБ в тяжелом стабильном состоянии. Цитогенетические параметры представлены в табл. 6.

Аналогичные изменения показателей ААХ можно проследить у больных с острой почечной недостаточностью, развивающейся как осложнение геморрагической лихорадки с почечным синдромом (ГЛПС), находящихся на лечении в отделении гемодиализа республиканской клинической больницы. В табл. 7 представлены показатели ААХ у больных К и Д, обследованных после одного сеанса гемодиализа.

Обобщая данные табл. 6 и 7 следует отметить, что для всех больных в стабильно тяжелом состоянии характерно следующее: существенное снижение показателей Кл0 указывает на подавление скорости пролиферации Т-клеток (вероятно вследствие интоксикации и развившегося на этом фоне вторичного иммунодефицитного состояния). Напротив, высокие значения Кл5> позволяют прийти к заключению о способности зрелых иммунокомпетентных клеток обеспечить адекватный иммунный ответ.

Четвертую группу составили пациенты, находящиеся на этапе постепенного выздоровления, при отсутствии признаков интоксикации и полностью компенсированной органной патологии, у которых наблюдается нормализация процессов клеточной пролиферации, тогда как уровень Кл5> остается высоким, что подтверждается следующим клиническим примером. Больной Я., 5 лет, находится на лечении в отделении реанимации РДКБ с диагнозом: деструктивный аппендицит, продолжающийся разлитой гнойный перитонит, сепсис. 13.01 в отделении произведена релапаротомия, санация брюшной полости. В послеоперационном периоде состояние ребенка постепенно улучшалось. 25.01 в стабильно тяжелом состоянии переведен в хирургическое отделение. Через 3 недели выписан. Цитогенетическое обследование проведено 24.01 и 2.02. Показатели ААХ представлены в табл. 8.

Все вышеперечисленные примеры характеризуют изменения показателей ААХ в связи с изменениями Т-клеточного иммунитета у больных с наличием антигенного стимула, то есть при инфекционных заболеваниях с различной степенью тяжести и стадией патологического процесса. В этой связи целесообразным представлялось проследить изменения показателей ААХ у больных с травматическим шоком при отсутствии явного антигенного стимула, составивших пятую группу. Рассмотрим конкретные клинические примеры N 14, 15, 16. Все больные находились в крайне тяжелом состоянии, обусловленном травматическим шоком вследствие острой черепно-мозговой травмы (ОЧМТ). Цитогенетические показатели представлены в табл. 9.

Оценивая показатели ААХ в этой группе больных, следует подчеркнуть наличие значительного снижения Кл0 по сравнению с контрольной группой. В то же время в кровеносном русле значительно возрастает содержание Кл5>. По-видимому, состояние стресса, вызванное травматическим шоком, обусловливает резкое торможение темпов генерации клеток, что выражается в значительном увеличении в периферической крови количества Кл5>.

Таким образом, полученные данные позволяют утверждать, что анализ изменений частоты ААХ способен отражать патогенез заболевания и развитие реакций иммунитета (см. чертеж). Так в состоянии септического шока (I группа) у больных наблюдалось значительное увеличение частоты Кл0 на 60% и более от контрольной группы на фоне полного отсутствия Кл5>. Клон клеток Кл0 можно считать вторичными малыми лимфоцитами, которые обрели морфологию малых лимфоцитов после бластной трансформации и пролиферации в периферических лимфоидных органах в ответ на антигенный стимул. Кл5> относятся к временно интактным лимфоцитам, пребывающим в процессе морфологического созревания, что определяет их способность к участию в специфических иммунных реакциях в очаге инфекции. Наблюдаемые нами изменения ААХ в критический период развития заболевания можно объяснить резкой активизацией процессов пролиферации лимфоцитов с одной стороны. С другой стороны, уменьшение числа Кл5> в периферическом кровеносном русле является следствием перераспределения в организме зрелых клеток (Кл5>) и депонированием их в очаге инфекции. Однако в динамике, при наличии эффекта от проводимых терапевтических мероприятий, количество Кл5> в крови постепенно повышается за счет созревания вновь пролиферировавших Т-лимфоцитов. В противном случае, т.е. при повторном отсутствии Кл5>, происходит нарушение процесса созревания Т-лимфоцитов, чем может быть обусловлен неблагоприятный исход заболевания.

Следующий этап развития острых гнойно-септических заболеваний, наблюдаемый у второй группы больных, характеризуется увеличением количества Кл0 от 20% и выше при появлении Кл5>. Наконец у больных III и IV группы, состояние которых постепенно улучшается, отмечается приближение к нормальным значениям Кл0 и даже некоторое снижение его, увеличивается число Кл5>. Снижение числа Кл0 происходит за счет двух основных причин. Во-первых, на фоне интенсивной антибактериальной и дезинтоксикационной терапии резко снижается доза антигена, который можно рассматривать как основной стимулятор процессов клеточной пролиферации. Другой причиной снижения Кл0, возможно, является депонирование молодых пролиферирующих клеток в местах локализации антигена, где развертываются специфические иммунные реакции.

Постепенно при санации патологических очагов уменьшаются проявления интоксикации (в частности, снижается концентрация эндогенных глюкокортикоидных гормонов), в периферической крови происходит медленное восстановление уровня (Кл0). У больных V группы, находящихся в состоянии травматического шока, наблюдается резкое торможение процессов клеточной пролиферации, на что указывает значительное уменьшение Кл0 на 60% и более при росте Кл5> более чем в два раза.

Следовательно, приведенные результаты позволяют считать, что по анализу ААХ в популяции периферических лимфоцитов можно оценивать реальную иммунореактивность человека (интенсивность процессов пролиферации, количество зрелых клеток) на самых разных стадиях развития иммунных реакций и прогнозировть развитие иммунитета в последующем.

Таким образом, с применением цитогенетических методов анализа процессов ассоциации акроцентрических хромосом в лимфоцитах периферической крови расширяются возможности более объективной оценки индивидуальной иммунореактивности, тяжести заболевания, прогнозирования возможных вариантов течения и исходов, выбора наиболее оптимальной патогенетической терапии.

Цитогенетический метод оценки активности Т-клеточного иммунитета должен получить широкое клиническое применение в медицинской практике наряду с общепринятыми иммунологическими тестами. В клинической медицине метод рекомендуется использовать во многих областях хирургии, реаниматологии, терапии, трансплантологии для контроля за иммунологическими изменениями в динамике развития заболевания с целью определения эффективности проводимой медикаментозной терапии, для обоснования необходимости подключения иммуномодулирующей терапии. Разработанные цитогенетические тесты определения количества Кл0 и Кл5> Т-лимфоцитов в периферической крови информативны и для дифференциальной диагностики иммунодефицитных состояний, вызванных как нарушением пролиферации лимфоцитов, так и несостоятельностью механизмов созревания иммунокомпетентных клеток. По сравнению с прототипом, рекомендующим его использовать только для определения активности Т-лимфоцитов по степени пролиферации, предлагаемый метод оценивает функциональную активность Т-лимфоцитов с учетом также участия Кл5> в иммунных реакциях организма. В области научно-теоретических исследований метод может быть успешно использован для изучения особенностей функционирования ядрышкообразующих районов акроцентрических хромосом в норме и патологии.

Одним из больших преимуществ предлагаемого метода является сокращение времени культивирования лимфоцитов, что позволяет быстро и адекватно оценивать функциональное состояние лимфоцитов на момент обследования.

Кроме того, данный метод может применяться как тест для оценки изменения иммунореактивности организма на общепринятые и новые способы лечения, а также с целью определения терапевтической эффективности при назначении иммунодепрессивной терапии при аутоиммунных и аллергических заболеваниях, в трансплантологии.

Формула изобретения

Способ оценки функциональной активности лимфоцитов крови пациента, включающий выделение их из пробы венозной крови и определение значимых показателей, отличающийся тем, что выделяют Т-лимфоциты, которые затем культивируют в течение 48 ч на питательной среде с добавлением фитогемагглютинина, после чего добавляют колхицин до конечной его концентрации 0,5 мкг/мл и дополнительно культивируют Т-лимфоциты в течение 2 ч, затем полученную культуральную жидкость центрифугируют, супернатант обрабатывают гипотоническим раствором и повторно центрифугируют, полученные лимфоциты фиксируют и готовят их препараты на предметных стеклах, в которых подсчитывают количество лимфоцитов, содержащих не менее пяти акроцентриков (КЛ5>) в одной акроцентрической ассоциации хромосом (ААХ), и количество лимфоцитов, не содержащих ААХ (КЛ0), после чего определяют процентное содержание указанных лимфоцитов от общего количества лимфоцитов, находящихся в метафазе, и при увеличении процентного содержания КЛ0 не менее чем на 20% по сравнению со значением указанного показателя, полученного у данного пациента ранее, и присутствии КЛ5> оценивают активность Т-лимфоцитов как адекватную, а при увеличении процентного содержания КЛ0 не менее чем на 60% по сравнению со значением указанного показателя, полученного у данного пациента ранее, и отсутствии КЛ5> или при снижении процентного содержания КЛ0 не менее чем на 60%, и увеличении процентного содержания КЛ5> более, чем в два раза по сравнению со значениями указанных показателей, полученными у данного пациента ранее, оценивают активность Т-лимфоцитов как пониженную.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4