Питательная среда для выделения возбудителя геморрагического колита с гемолитико-уремическим синдромом, вызываемого кишечной палочкой 0157:н7 (сорбитол e.coli 0157:н7агар)

 

Изобретение касается медицинской микробиологии и может быть использовано для выявления кишечной палочки 0157 : H7 в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и от больных людей. Среда содержит в качестве белкового компонента панкреатический гидролизат рыбной муки, в качестве углеводного компонента - сорбитол, кроме этого, экстракт пекарных дрожжей, натрия сульфит, натрия хлорид, натрия фосфат, фуксин основной в качестве красителя и агар микробиологический и воду при определенном соотношении компонентов. Изобретение обеспечивает возможность использовать среду в полевых условиях для первичного выделения и дифференциации возбудителя геморрагического колита. Среда проста в приготовлении, улучшает дифференциацию за счет появления металлического блеска колоний. 1 табл.

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано для выявления кишечной палочки 0157:Н7 в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и от больных людей.

Этиологическая роль Е. coli 0157:Н7 как возбудителя геморрагического колита установлена сравнительно недавно. Тем не менее вспышки и спорадические случаи острых кишечных инфекций, вызываемых Е. coli 0157:Н7, уже зарегистрированы в большинстве стран мира: США, Канаде, Великобритании и Японии.

Не менее тревожная обстановка сложилась в Российской Федерации. В течение 1994-95 гг. зарегистрировано 35 вспышек острых кишечных инфекций водного и 137 вспышек пищевого характера, в результате которых заболело свыше 19 тыс. человек. В первом квартале 1996 г в России произошло 16 вспышек острых кишечных инфекций. Около 60% заболевших составили дети до 14 лет, при этом более половины из них в возрасте до 2 лет. Этиология большинства случаев острых кишечных инфекций, в том числе осложненных гемолитико-уремическим синдромом, остается невыясненной. С большой вероятностью можно предположить, что среди нерасшифрованных острых кишечных инфекций имеет место инфекция, вызываемая энтерогеморрагическими Е. coli серотипа 0157:Н7.

Большую озабоченность вызывает быстрый рост заболеваемости и высокая смертность (до 2,5%).

Сложная санитарно-эпидемическая ситуация в России (завоз мяса, мясных и молочных продуктов из-за рубежа, широкая сеть частных предприятий торговли и питания) требует более тщательного проведения бактериологического контроля с применением специальных питательных сред с целью быстрого обнаружения возбудителя данного заболевания и пресечения завоза возбудителя с продуктами питания из-за заграницы.

В России в настоящий момент отсутствуют питательные среды для выделения кишечной палочки 0157:1-Н7 - возбудителя геморрагического колита с гемолитико-уремическим синдромом. Угроза заноса данного возбудителя в Россию и появление вспышки данного заболевания внутри страны являются предпосылками для создания такой среды.

Ведущими зарубежными фирмами Difco, bioLife, Merck выпускаются среды для выделения кишечной палочки 0157:Н7 Mac Conkey Sorbitol Agar, Fluorocult E. coli 0157:Н7 agar (1, 2, 3).

Наиболее близкой по назначению к предлагаемой среде является Mac Conkey Sorbitol Agar, выпускаемой фирмами bioLife (2), состоящей из следующих компонентов, г/л: Peptomeat - 17,0 Peptocomplex - 3,0 Bile Salts N 3 - 5,0 D-Sorbitol - 10,0 Sodium chloride - 5,0 Neutral Red - 0,03 Cristal Violet - 0,001 MUG - 0,1 Agar Bios LL - 14,5
Использование этой среды позволяет четко дифференцировать штаммы серогруппы 0157:Н7 от других эшерихий.

Недостатками этой среды являются многокомпонентный состав, включающий дорогостоящие мясные казеиновые перевары и экстракты, а также среда требует автоклавирования, что затрудняет ее использование в полевых условиях. Отсутствие этих сред на российском рынке не обеспечивает достаточного опыта работы с этой средой в практике здравоохранения.

В связи с вышеизложенным задачей изобретения является создание отечественной питательной среды из дешевых компонентов, обеспечивающей возможность использовать среду в полевых условиях с целью первичного выделения и дифференциации возбудителя геморрагического колита с гемолитико-уремическим синдромом - кишечной палочки 0157:Н7, отражающей условия и стереотипы работы наших диагностических лабораторий и сводящей до минимума перестройку производственного процесса при выпуске среды.

Поставленная задача решается сбалансированностью компонентного состава среды, содержащей в качестве белкового компонента панкреатический гидролизат рыбной муки, в качестве углеводного компонента - сорбитол, кроме этого, экстракт пекарных дрожжей, натрия сульфит, натрия хлорид, натрия фосфат, фуксин основной в качестве красителя и агар микробиологический при следующем соотношении компонентов, г/л:
панкреатический гидролизат рыбной муки - 10,0-14,0
экстракт пекарных дрожжей - 0,8-1,2
сорбитол - 8,0-12,0
натрия хлорид - 3,0-4,0
натрия сульфит - 0,75-0,85
натрия фосфат - 0,45-0,55
фуксин основной - 0,18-0,22
агар микробиологический - 8,0-12,0
дистиллированная вода - остальное
Количественное соотношение компонентов позволяет обеспечивать хорошую первичную дифференциацию штаммов серогруппы Е. coli 0157:H7 от других эшерихий через 16-18 часов. Производство панкреатического гидролизата рыбной муки и экстракта пекарных дрожжей налажено в отделении "Питательные среды" ГНЦ ПМ, поэтому выпускать данную среду в условиях уже имеющихся производств ГНЦ ПМ возможно без изменения технологических процессов и дополнительных материальных затрат.

Пример 1.

Для приготовления питательной среды берут следующие навески компонентов, г/л:
панкреатический гидролизат рыбной муки - 12,0
экстракт пекарных дрожжей - 1,0
сорбитол - 10,0
натрия хлорид - 3,4
натрия сульфит - 0,8
натрия фосфат - 0,5
фуксин основной - 0,2
агар микробиологический - 10,0
дистиллированная вода - остальное
Навески тщательно перемешивают в 1 л дистиллированной воды, нагревают до кипения и кипятят в течение 2-3 мин до полного растворения агара. Охлаждают до 45-50^oС и разливают в чашки Петри слоем 5-7 мм. Перед посевом чашки со средой подсушивают в течение 30 мин при комнатной температуре.

Эффективность среды проверяли на следующих тест-штаммах: Е. coli 0157:Н7 (NN 904, 1282, 120, 212, 214); Е. coli 3912/41 (055:K59); Shigella dysenteriae 1 1362; Salmonella paratyphi A, B; Salmonella typhimurium 79; S. aureus Wood-46; S. faecalis.

Микробную взвесь каждого из тест-штамма, приготовленного в стерильном 0,9%-ном растворе хлорида натрия с концентрацией, соответствующей 10 единицам по стандарту мутности путем десятикратных разведений доводили до концентрации 100 м.к./мл. На чашку Петри со средой засевали по 0,1 мл микробной взвеси каждого из тест-штамма из разведения с концентрацией 100 м.к./мл. Посевы инкубировали при температуре (37±1)^oC в течение 18-20 ч. Учет результатов проводили визуально. Через 18-20 ч культивирования колонии тест-штамма Е. coli 0157:Н7 были бесцветные, круглые, диаметром 1,5-2,0 мм; колонии тест-штаммов Е. coli 3912/41 (055:K59), Salmonella paratyphi А, В, Salmonella typhimurium 79 - малиновые, с металлическим блеском, круглые, ровные, диаметром 1,5-2,5 мм, колонии тест-штамма Shigella dysenteriae 1 1362 - розовые, мелкие, круглые, диаметром до 1,0 мм. Рост S. aureus Wood-46 и S. faecalis полностью отсутствует.

Пример 2.

Для приготовления питательной среды берут следующие навески компонентов, г/л:
панкреатический гидролизат рыбной муки - 10,0
экстракт пекарных дрожжей - 0,8
сорбитол - 8,0
натрия хлорид - 3,0
натрия сульфит - 0,75
натрия фосфат - 0,45
фуксин основной - 0,18
агар микробиологический - 8,0
дистиллированная вода - остальное
Приготовление и биологический контроль среды проводили в соответствии с примером 1. Результаты контроля представлены в таблице.

Пример 3.

Для приготовления питательной среды берут следующие навески компонентов, г/л:
панкреатический гидролизат рыбной муки - 14,0
экстракт пекарных дрожжей - 1,2
сорбитол - 12,0
натрия хлорид - 4,0
натрия сульфит - 0,85
натрия фосфат - 0,55
фуксин основной - 0,22
агар микробиологический - 12,0
дистиллированная вода - остальное
Приготовление и биологический контроль среды проводили в соответствии с примером 1. Результаты контроля представлены в таблице.

Из таблицы видно, что предлагаемая питательная среда обладает хорошими ростовыми свойствами, высокой точностью дифференциации штаммов серогруппы Е. coli 0157:Н7 от других энтеробактерий, подавляет рост стафилококка и стрептококка.

Нарушение количественного соотношения компонентов среды ведет к резкому ухудшению показателей качества предложенной среды и затрудняет дифференциацию.

Таким образом, по сравнению со средой-прототипом предлагаемая среда имеет ряд преимуществ:
не содержит дорогостоящих мясных и казеиновых переваров и экстрактов;
улучшает дифференциацию за счет появления металлического блеска колоний;
проста в приготовлении: не требует автоклавирования, достаточно 3 минут кипячения;
возможно применение в полевых условиях;
не меняет стереотипов работы диагностических лабораторий практического здравоохранения.

Источники информации принятые во внимание
1. Difco, Laboratories PO BOX 331058 Detroit Mi 48232-7058 USA, 1992, р. 3.

2. BioLife Manual, Second edition, printed in Italy, by INGRAF, Milan, 1991, p. 88.

3. Microbiology Manual, Merck, 1996, p. 316.

Формула изобретения

Питательная среда для выделения возбудителя гемморрагического колита с гемолитико-уремическим синдромом, содержащая источник азотного питания, сорбитол, натрия хлорид, краситель, агар микробиологический, воду дистиллированную, отличающаяся тем, что в качестве источника азотного питания содержит панкреатический гидролизат рыбной муки, в качестве красителя - фуксин основной и дополнительно содержит экстракт пекарных дрожжей, натрия сульфит и натрия фосфат при следующем соотношении компонентов, г/л:
Панкреатический гидролизат рыбной муки - 10,0 - 14,0
Экстракт пекарных дрожжей - 0,8 - 1,2
Сорбитол - 8,0 - 12,0
Натрия хлорид - 3,0 - 4,0
Натрия сульфит - 0,75 - 0,85
Натрия фосфат - 0,45 - 0,55
Фуксин основной - 0,18 - 0,22
Агар микробиологический - 8,0 - 12,0
Дистиллированная вода - Остальное

РИСУНКИ

Рисунок 1