Способ получения иммуноглобулина противодифтерийного человека

 

Изобретение относится к области медицины и касается способов получения лечебных препаратов из крови иммунизированных доноров, в частности к способам получения противодифтерийного иммуноглобулина человека для внутривенного введения. У доноров через 30 дней после иммунизации дифтерийным анатоксином забирают кровь. Отбирают плазму крови с титром противодифтерийных антител 1: 160 и выше. Формируют котловую смесь с содержанием противодифтерийных антител не менее 1:1280. Затем фракционируют плазму крови спиртовым методом при низких температурах. Целевой продукт получают в виде раствора противодифтерийного иммуноглобулина человека. Полученный препарат является гомологичным. не вызывает осложнений аллергического типа, обладает высокой специфичностью и эффективностью при лечении больных дифтерией, особенно больных с повышенной чувствительностью к гетерологичному белку. 1 табл.

Изобретение относится к области медицины и касается получения лечебных препаратов из крови иммунизированных доноров.

Известен способ получения иммуноглобулина нормального человеческого для внутривенного введения (см. Регламент производства иммуноглобулина нормального человеческого для внутривенного введения N 143-80 от 18.02.80 г.), который заключается в следующем: у доноров без предварительной вакцинации берут кровь, выделяют плазму, получают сухой иммуноглобулин методом спиртового фракционирования по Кону, который затем для снижения антикомплементарной активности обрабатывают пепсином в слабокислой среде.

Недостатком указанного способа является то, что иммуноглобулин нормальный человеческий для внутривенного введения содержит противодифтерийные антитела в низком титре (2-3 МЕ/мл) и не является лечебным препаратом в отношении дифтерии.

Известен способ получения противодифтерийной лошадиной сыворотки (см. "Руководство по вакцинному и сывороточному делу", ред. П.Н. Бургасов, М.: Медицина, 1978. - с. 274-278).

Лошадей гипериммунизируют дифтерийным анатоксином. Нативные сыворотки в дальнейшем подвергают очистке и концентрации. Специфическая активность препарата составляет 2000-2400 МЕ/мл. Противодифтерийную сыворотку вводят подкожно и внутримышечно (прототип).

Недостатком указанного способа является то, что применение этих сывороток сопровождается реакциями аллергического типа, потому что приготовленные препараты содержат гетерогенный белок, который может вызвать сывороточную болезнь или аллергический шок.

Задачей данного изобретения является получение нового препарата - иммуноглобулина противодифтерийного человека для внутривенного введения с высоким титром специфических антител.

Сущность изобретения состоит в том, что получение препарата достигается путем иммунизации доноров дифтерийным анатоксином, взятия крови, фракционирования плазмы, причем взятие крови производят через 30 дней после иммунизации, отбирают плазму с титром противодифтерийных антител по РПГА 1:160 и выше, титр котловой смеси составляет не менее 1:1280.

Пример конкретного выполнения.

Группу доноров из 220 человек в возрасте 18-25 лет, подобранных в соответствии с "Инструкцией по медицинскому освидетельствованию доноров крови (М. ,1978), прививают в плановом порядке однократно адсорбированным дифтерийным анатоксином с уменьшенным содержанием дифтерийного антигена (АД-М) в соответствии с приказом МЗ СССР N 450 от 02.04.86 г., в дозе 0,5 мл подкожно в подлопаточную область. Через 30 дней проводят взятие крови, отделяют плазму. В пробах плазмы определяют уровень антитоксина в реакции пассивной гемагглютинации(РПГА) по общепринятой методике (см. "Инструкция по применению диагностикума эритроцитарного дифтерийного антигенного жидкого", утв. 29.12.89 г. МЗ СССР). Для получения иммуноглобулина отбирают плазму доноров с титром антител ≥ 1:160. В реактор загружают котловую смесь иммунной плазмы с содержанием противодифтерийных антител не ниже 1:1280.

Выделение специфической иммуноглобулиновой фракции проводят спиртовым методом при низких температурах, фракционирование ведут до стадии получения сухого иммуноглобулина. Сухой осадок препарата растворяют в дистиллированной воде с добавлением физиологического раствора. Для снижения антикомплементарной активности препарата проводят кислотно-ферментативный гидролиз, при этом pH раствора доводят до 3,9-4,1 и добавляют пепсин. Через 18-20 часов избыток пепсина удаляют, pH раствора доводят до 6,5-7,5, проводят стерилизующую фильтрацию и выстаивают в течение месяца во фриго. Выпавший осадок удаляют, стерилизуют раствор фильтрацией, получают готовый препарат, который разливают во флаконы.

Новый препарат - иммуноглобулин противодифтерийный человека для внутривенного введения представляет собой жидкость бесцветную или со слабо-желтой окраской, прозрачную или слегка опалесцирующую. pH иммуноглобулина 7,0±0,5, белок - (5±0,5)%. Фракция иммуноглобулина составляет не менее 97% общего белка. На иммунофореграмме выявляется интенсивная дуга преципитации, соответствующая Ig G и одна дополнительная дуга. Препарат содержит мономеров не менее 60%, димеров - не более 10%, фрагментов - не более 30%.

Специфическая активность иммуноглобулина составляет не менее 8 МЕ/мл, одна доза (25 мл), содержит ≥200 ME.

Препарат обладает низкой антикомплементарной активностью: две 50% гемолитические единицы комплемента сохраняют активность в присутствии не менее 10 мг белка иммуноглобулина. Препарат стерилен, апирогенен, термостабилен, атоксичен. Иммуноглобулин противодифтерийный человека для внутривенного введения эффективен при лечении всех форм дифтерии, обладает быстрым действием, не вызывает аллергических реакций, вводится взрослым и детям. Использование предлагаемого изобретения позволит решить вопрос лечения тяжелых токсических форм дифтерии у детей и взрослых, особенно лиц с повышенной чувствительностью к гетерологичному белку.

Обоснование выбранных параметров 1. Обоснован срок взятия крови у доноров при получении иммуноглобулина противодифтерийного человека - через 30 дней после иммунизации.

Группу доноров из 30 человек в возрасте 20-22 лет, однотипных по физическому развитию, питанию, режиму проживания, иммунизировали однократно адсорбированным дифтерийным анатоксином (АД-М) в дозе 0,5 мл подкожно в подлопаточную область. Пробы крови брали в динамике: фон (до прививки), через 7, 14, 21, 30, 40 дней после иммунизации и определяли у доноров титр противодифтерийных антител. Результаты представлены в таблице.

Представленные в таблице результаты показывают, что максимальный процент доноров с титром противодифтерийных антител 1:160 и выше по РПГА наблюдается на 30 день после иммунизации. Дальнейшее наблюдение не ведет к увеличению числа доноров с титром антител >1:160. Следовательно, срок через 30 дней после иммунизации является оптимальным для взятия крови у доноров и получения иммуноглобулина.

2. Обоснована необходимость отбора плазмы с титром противодифтерийных антител ≥ 1:160 и формирование котловой смеси плазмы с титром ≥ 1:1280 для получения противодифтерийного иммуноглобулина. Для этого было сформировано два пула донорской плазмы: 1) из плазмы с титром противодифтерийных антител ≥ 1: 160 (1:160, 1:320, 1:640 и т.д.) и 2) из плазмы с титрами антител ≥ 1: 40 (1:40, 1:80, 1:160 и т.д.). Первая иммунная противодифтерийная плазма имела титр антител 1:1280, вторая - титр антител 1:320, что связано с добавлением плазмы с низкими титрами, В результате получение донорского противодифтерийного иммуноглобулина из второго пула плазмы было невозможным.

Таким образом, отбор плазмы с титрами противодифтерийных антител 1:160 и получение пула сывороток с титром ≥ 1:1280 является необходимым условием получения противодифтерийного иммуноглобулина.

Преимущества заявляемого способа.

При осуществлении способа получен новый препарат - иммуноглобулин противодифтерийный человека для внутривенного введения для лечения больных всеми формами дифтерии. Противодифтерийный иммуноглобулин является гомологичным препаратом, не вызывает осложнений аллергического типа, содержит в высоком титре противодифтерийные антитела, обладает специфичностью и высокой эффективностью при лечении больных дифтерией, особенно лиц с повышенной чувствительностью к гетерологичному белку.

В настоящее время препарат проходит клинические испытания.

Формула изобретения

Способ получения противодифтерийного иммуноглобулина человека, включающий иммунизацию доноров дифтерийным анатоксином, взятие у доноров крови, фракционирование плазмы спиртовым методом при низких температурах и выделение целевого продукта, при этом взятие крови проводят через 30 дней после иммунизации доноров, отбирают плазму крови с титром противодифтерийных антител 1 : 160 и выше и формируют котловую смесь плазмы с титром не менее 1 : 1280, из которой выделяют целевой продукт с получением готового препарата в виде раствора противодифтерийного иммуноглобулина человека для внутривенного введения.

РИСУНКИ

Рисунок 1

PD4A - Изменение наименования обладателя патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:Федеральное государственное унитарное предприятие "Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам "Микроген" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Извещение опубликовано: 27.02.2005        БИ: 06/2005

---